时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA)试剂临床应用

1、时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA 试剂临床应用研究徐伟文1, 吴英松1, 杭建峰1, 王从容2, 张国兰3, 余伟鸿3, 裘宇容2, 李明1(11南方医科大学热带病研究室, 广东广州510515; 21南方医科大学附属南方医院检验科, 广东广州510515; 31广州市达瑞抗体工程技术有限公司, 广东广州510663摘要:目的对自制时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA 床疗效评价提供科学依据。方法收集血清标本326份, , 并以化学发光法(Roche 为对照方法, W ALLA C 公司的CEA u toD F T , 获取相关目标实验数据, 并计算得“真实性”和“可靠性”,

2、其阳性符合率为95183%, 阴性符合率为98173%, ; , 相关系数达0193, 相关性好。, 能满足临床应用的需要。关键词:; 中图分类号:Q 446:A 文章编号:167127414(2005 062028204The Cl i n ic Study of the Carc i noem bryon icAn tigen (CEA Quan tita tive D i agnostic K it w ith TRF I AXU W ei 2w en 1, W U Y ing 2song 1, HAN G J ian 2feng 1,W AN G Cong 2rong 2, ZHAN

3、G Guo 2lan 2, YU W ei 2hong 3, Q I U Yu 2rong 2, L IM ing1(1. T he D ep a rt m en t of T rop ica l m ed icine , S ou th M ed ica l U n iversity , Guang d ong Guang z hou 510515, Ch ina ; 2. C lin ica l L abora tory , N anf ang H osp ita l , Guang d ong Guang z hou 510515, Ch ina ; 3. Guang z hou D a

4、 ru i A n tibody E ng ineering Co . L td , Guang d ong Guang z hou 510663, Ch ina Abstract :Objective U sing the techn ique of ti m ed 2reso lved fluo ro i m m unoassay (TR F I A , carcinoem b ryon ic an tigen (CEA quan titative diagno stic k it has been successfu lly developed . A nd the capab ilit

5、y of the k it has been evaluated . M eth 2ods In th is study , the clin ic evaluati on has been undertaken . In research 326b lood samp les w ere co llected fo r CEA detect 2ing analysis . Results Comparing to the techn ique of chem ilum inescence i m m unoassay (CL I A , the po sitive acco rdan t r

6、ati o of diagno stic k it w as 95. 83%, w h ile the negative acco rdan t rati o w as 98. 73%.M eanw h ile , the relativity of diagno stic k it w ith CL I A w as w ell , and the relative coefficien t w as 0. 93. Conclusion A ll the resu lts of the param eters evaluated show ed that the diagno stic k

7、it developed cou ld m eet the need of the clin ic app licati on .Keywords :carcinoem b ryon ic an tigen (CEA ; ti m ed 2reso lved fluo ro i m m unoassay (TR F I A ; chem ilum inescence i m m unoas 2say (CL I A 癌胚抗原(Carcinoem b ryon ic an tigen , CEA 是一种多糖蛋白复合物, 属于非器官特异性肿瘤相关抗原, 是肿瘤诊断和病情监测中最常用的一种肿瘤标志物

8、之一1, 2。分泌CEA 的肿瘤大多位于空腔脏器, 如胃肠道、呼吸道、泌尿道等。正常情况下, CEA 经胃肠道代谢, 而肿瘤状态时的CEA 则进入血液和淋巴循环, 引起血清CEA 异常增高, 使上述各种肿瘤患者的血清CEA 均增高。如肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌患者血清CEA 量会明显升高, 大多显示为肿瘤浸润, 其中约有70%为转移性癌。手术切除后2w , CEA 水平恢复正常, 否则提示有残存肿瘤, 若CEA 浓度持续不断增高, 或其数值超过正常56倍者均提示预后不良。连续随访定量检测血清CEA 含量, 对肿瘤病情判断更具有意义。目前临床检测血清CEA 多用放射免疫法、(电 化学发光法或E

9、L ISA 法3。EL ISA 法灵敏度及稳定性不够好, 放射免疫法虽然有较好的灵敏度, 但稳定性欠佳, 且有放射性污染之嫌, 而且操作时间长。(电 化学发光法虽然有较好的灵敏度和稳定性, 但目前试剂和仪器全部为进口产品, 成本相对较高。时间分辨免疫荧光分析(T i m ed 2reso lved fluo 2ro i m m unoassay , TR F I A 是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的新型的非放射性免疫标记技术, 它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点, 使非特异性信号降低到可以忽略的程度, 达到了极高的信噪

10、比, 从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度, 且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自82现代检验医学杂志2005年11月第20卷第 6期J M od L ab M ed , N ovem ber 2005, V o l . 20, N o . 6基金项目:本课题为广州市创新条件建设项目(2003U 13B 0021作者简介:徐伟文(1970- , 女, 博士后, 副研究员。然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点47, 成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑, 已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分

11、析手段。目前, 我们已成功建立了时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA 的反应模, 确定了该检测试剂盒的生产工艺8, 同时对该试剂盒的准确度、精密度、剂量2反应曲线、最低检测量、稳定性、特异性等产品性能进行了测定和评估9。为评估该试剂盒的临床应用价值, 临床应用研究。1材料与方法111癌胚抗原( 剂盒, 以下简称“CEA 2TR F I A ”, CEA 化学发光测试试剂盒(Roche 公司 , A u toD EL F I A TMhCEA (W ALLA C 公司 。国家CEA 质控品(Q C 、Q C , 期望浓度分别为25, 50ng m l , 购自中国生物制品药品检定所。血清标

12、本:由南方医院检验科提供, 阳性168例, 阴性158例, 共326例; 临床标本对象入选标准以临床(电 化学发光法测定CEA 值为依据判断。实验仪器:A u to 2D elfia 1235时间分辨荧光检测仪(Perk in E l m er 公司 。112方法11211试验设计:CEA 2TR F I A 试剂盒测定时每个反应板上采用两个浓度的CEA 质控血清(各设2复孔 进行质量控制。第一次试验结果的差异样本用自制试剂盒做重复试验(各设3复孔 , 同时用W allac 药盒做复核试验(2复孔 。11212试验操作:按各试剂盒内说明书进行。11213结果判断标准:质控血清:各质控物的平均值

13、在允许范围内; 10%, 则此反。Roche 05ng m l ,I hCEA 检测试剂正常值范围05l , 自制CEA 2TR F I A 检测试剂正常值范围06. 5ng m l 。11214统计处理:符合率计算:以化学发光法为对照, 分别计算阴阳性符合率及总符合率, 并进行t 检验。相关性分析:以化学发光法为试验的对照标准, 用SPSS 1110统计软件对检测数据进行统计学分析, 分别计算相关系数并进行检验。2结果211可靠性考核结果对326份血样进行临床应用试验, 共用5套试剂盒, 每个反应板上采用CEA 质控品 (25ng m l 和CEA 质控品 (50ng m l 两个浓度的质控

14、血清进行质量控制(每一质控血清各做2复孔 。各考核用反应板内质控血清所测浓度值及统计结果见表1。可见每反应板各质控物的平均值在允许范围内且重复样本的测定结果相差在10%以内, 符合质控标准, 试验可靠。表1临床试验可靠性考核结果质控物C 11C 12CV (%C 21C 22CV (%C 31C 32CV (%C 41C 42CV (% C 51C 52CV (%Q C101134129167381531181412 12391411153616412512910530148116281571341691383018101134115127129178371510163316517718注:表

15、中C 11代表第一块测试反应板第一复孔的测定浓度, C 12代表第一块测试反应板第二复孔的测定浓度, 依次类推。浓度单位为ng m l 。图1CEA 2TR F I A 诊断试剂的ROC 曲线212RO C 曲线及曲线下面积将326份临床血样的检测结果用SPSS 1115统计软件进行分析, 并绘制RO C 曲线。可见自制的CEA 2TR F I A 诊断试剂在图中表现为RO C 曲线从原点几乎垂直上升至接近左上角, 然后水平达到右上角。RO C 曲线下面积(A z 达01980, 说明本试剂盒的检测性能优秀(图1 。213临床应用统计分析326份临床标本的CL I 2A 及CEA 2TR F

16、I A 法测定统计结果见表2。检验结果, CEA 2TR F I A 与CL I A 的检验效能无显著性差异(P 0105 。表2CEA 2TRF I A 与CL I A 法临床检测结果统计归纳表试验法阳性阴性 合计TRFI A 法阳性阴性16172156163163合计168158326阳性符合率=161 168100%=95183%; 阴性符合率=156 158100%=98173%; 总符合率=(161+156 326100%=97124%。92现代检验医学杂志2005年11月第20卷第6期J M od L ab M ed , N ovem ber 2005, V o l . 20, N

17、 o . 6对326份临床样本TR F I A 法测定的CEA 值与化学发光法的测定值进行相关性分析。结果, TR F I A 法与CL I A 法的相关系数r =0193, P =01000, 相关方程为TR F 值(Y =11021CL I A 值(X +231671。从相关系数及检验结果看, 我们自制的试剂盒与目前临床广泛应用的化学发光法相关性良好。214差异样本的进一步分析按化学发光法(CL I A , Roche 设定的Cu toff 值(5ng m l 及自制试剂盒推荐的Cu toff 值(6. 5ng m l , 326样本中有9个样本与CL I A 法检测值判断结果不符。以CL

18、 I A 法为对照标准, 其中假阴性7个, 假阳性2个。对这9个差异血样再次进行自制试剂盒的重复试验(T FR 2、3、4 及W allac 公司的时间分辨荧光免疫试剂盒的复核试验作进一步分析, 结果见表3。由表可见, 9次测值一致, 其中8W allac 复核、稳表3(ng m l 编号值TRF 2TRF 3TRF 4W allac 复核值1W allac 复核值21815641838487166216297814821241252156510621131825169107818011675211231231112315651128168814211814117113531101814102

19、510681568104210341811123518601993108419881268148212412521565106211318251661257146213416311725171312121512198714271882104415211565146311221563116注:TR F 2、3、4分别为重复试验测值; TR F 法Cutoff 值为6. 5ng m l , CL I A 及W allac 药盒的Cutoff 值均为5ng m l 。对于样本测值的差异, 初步考虑有以下几个因素:由于CEA 抗原上有多个结合位点, 不同的单抗其发生作用的结合位点可能不一样, 结合能力

20、也可能不一致, 而不同公司的试剂盒、不同方法所选用的单抗可能不一样, 导致所测结果的不一致; 部分差异样本CEA 的测值在正常参考值范围的上限附近(5. 0ng m l , 这种临界值有可能致判断结果的不定性, 需要进一步作临床追踪检测才可能进行试验结果的判断和临床意义的分析。3讨论一种新开发的体外诊断试剂产品在完成研制生产后, 均要对该产品的适用性和可靠性等性能进行测定和评价。试剂盒的灵敏性、重复性、准确性、精密性、特异性和耐用性(可靠性 等参数是首先必须考核的指标9 。另一方面, 通过对大量临床标本的检测, 并将结果与同类产品或方法进行比较、统计、分析来综合考核与评价, 也是考核体外诊断试

21、剂临床实际性能的重要内容, 是综合评价新研发产品灵敏度和特异性的重要试验资料10。有关体外诊断试剂的临床研究, 我国尚没有出台相关法规进行规范, 但其他关于新药临床研究的实用操作也有不少资料可供借鉴11, 12。根据我们自己所进行的临床研究及新药报批的经验, 我们认为, 在进行临床考核之前, 一定要首先明确考核的目的, 根据科学的方法设计临床考核方案, 同时综合考虑新药报批审评的有关要求与规范, 进行临床试验的落实, 并选用合适的统计方法进行分析, 是十分重要的。对于临床试验, 标本的代表性、对照方法的可比性、试验方法的可靠性、以及考核实施的管理是非常关键的环节。对被检测指标有“金标准”的,

22、一定要与金标准进行比较, 此时平行检测入选标本, 得出的“阴阳性”结果与“金标准”比较, 就可得出新试剂的灵敏度和特异性。没有金标准的, 尽量与已批准的或国际公认的灵敏度和特异性较好的同类产品进行比较, 比较的结果可以采用22表统计, 但不能用灵敏度和特异性表述了, 只能称作符合率。对于检测不一致的标本, 应进行进一步的分析确证, 如可以进行临床追踪或使用第三种试剂或方法检测。就我们“时间分辨免疫荧光法定量检测癌胚抗原(CEA 试剂盒”的临床应用结果来看, 以化学发光法为对照试验, 其阳性符合率为95183%, 阴性符合率98173%, 检验无显著性差异; 自制试剂盒的定量测定值与化学发光法的

23、测定值比较一致, 相关系数达0193, 检验表明相关性良好。综合对差异样本的进一步分析, 表明我们的试剂盒检测性能与现在临床广泛应用的化学发光法方法相仿13, 14, 且成本相对较低, 能满足临床应用的需要, 与他人的研究也较一致15。而与目前临床体检常用的放射3现代检验医学杂志2005年11月第20卷第6期J M od L ab M ed , N ovem ber 2005, V o l . 20, N o . 6免疫法比较, 我们的试剂盒在性能上要优于它, 具有操作简单, 费时短, 所需血清量少, 且无放射性污染的潜在危害, 如能进一步降低成本, 有望推广应用。参考文献:1陈永伟, 肖华龙

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25、ng ti m e 2re 2so lved fluo ro i m m unoassay J . A na l S ci , 2003, 19(2 L 20521016Yam ada H , Am ano M , O kuaz w a K , et a l . M atu ra 2ti onal changes in b rain con ten ts of Sal mon GnRH in rainbow trou t as m easu red by a new ly developed ti m e 2reso lved fluo ro i m m unoassay J . Gen Co

26、 m p E n 2d ocrinol , 2002, 126(2 :13614317Peru sk i A H , John son L H 3rd , Peru sk i L F J r . R ap idand sen sitive detecti on of b i o logical w arfare agen ts u sing ti m e 2reso lved fluo rescence assays J . J Im 2m unol M ethod s ; 2002, 263(1-2 :354118杭建峰, 吴英松, 徐伟文, 等1人癌胚抗原(hCEA 时间分辨免疫荧光分析试

27、剂盒的研制J 1上海免疫学杂志(待发表 19张庆生1分析方法的验证J 1中国新药与临床药理, 1999, 10(6 :3763791101, : www . sda . gov . cn , 2004221对体外诊断试剂临床考核部分的审评体会J OL 1中国国家食品药品监督管理局电子刊物,h ttp : www . sda . gov . cn , 2004207228112王瑞莲1新药临床研究实用手册设计、执行和分析M 1北京:化学工业出版社, 2003113卓小兰1化学发光法检测肿瘤四项在临床上的应用J 1海南医学, 2001, 12(6 :63114曲冬, 佟太勋, 徐峰1CA 1929

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