一点红总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究

1、一点红总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究        【摘要】     目的探讨一点红总黄酮的提取、鉴别及对羟自由基清除作用，以充分利用一点红植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从一点红中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量，用一点红总黄酮对羟自由基清除作用进行试验。结果测得样品中总黄酮的含量C=0.816 8 mg/ml，回收率为100 %，其纯度和产率均较高。结论该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取一点红黄

2、酮类物质的有效途径。一点红总黄酮提取液对Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除作用。     【关键词】  超声波提取 一点红 总黄酮 鉴别 自由基 清除    Extraction of the Total Flavanone from Emilia sonchifolia DC. and Its Effect on Hydroxyl RadicalLIAO Li，LUO Jianhua，MENG Chunyue， ZHANG Lidan，FENG Ling，PAN Longji, H

3、UANG Suoyi1. Beihai Radio and Television University, Beihai, Guangxi 536000, China; 2. Department of Chemistry, Youjiang Medical College for Nationalities，Baise, Guangxi 533000，China）Abstract：ObjectiveTo study the extraction method of the total flavanone from Emilia sonchifolia DC and its effec

4、t on of hydroxyl radical. MethodsThe flavonoids were extracted with ethanol as the solvent from Emilia sonchifolia DC by ultrasonic wave. Spectrophotometry was used to determine sthe content of the flavanone of Emilia sonchifolia DCThe effect of extract of Emilia sonchifolia DC on hydroxyl radical w

5、as studiedResultsBy this method the content of the total flavanone from  Emilia sonchifolia DC was C=0.8168 mg/ml and the rate of recovery was 100%. ConclusionThis text provides the extraction and purification methods to get the outcome and the purity of the flavanone is high .This method is a

6、purely physical process and has no pollution. It is an ideal way to extract the flavanone from Emilia sonchifolia DC.  Emilia sonchifolia DC has a scavenging action on hydroxyl radical.Key words：Ultrasonic wave treatment；  Emilia sonchifolia DC；  Total flavanone；  Identification；

7、  Hydroxyl radical；  Scavenging一点红Emilia sonchifolia DC,又名羊蹄草、红背叶、叶下红、红背果等，菊科一点红属一年生或多年生草本，分布于我国华南、华中和西南等地。一点红性味凉，具清热解毒、活血散淤之功效。可治菌痢、急性肠炎、泌尿系感染、咽喉炎、跌打肿痛、毒疮等。一点红采摘嫩梢供食，沸水焯后，加蒜蓉炒食，作汤。食味柔滑，清香可口1。临床上常用于治疗上呼吸道感染、口腔溃疡、肺炎、乳腺炎、疖肿疮疡、皮肤湿疹等2。一点红是印度喀拉拉邦用来治疗炎症、蚊虫叮咬、结膜炎、风湿病及创伤等的一种植物药，已报道该植物地上部分含有吡咯双烷类生物

8、碱和黄酮类化合物，并且首次发现一点红的抗氧化和抗炎作用，黄酮类为其作用的活性成分3。目前国内外对一点红总黄酮的研究还相当的缺乏。黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无副作用，并以此开发出多种药品和保健食品4 。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道5，6，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提

9、取成分的影响6。但超声技术应用于提取一点红中黄酮类物质的研究尚未见报道。为此，本实验用超声波乙醇浸提法提取一点红总黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟自由基的清除作用。现报道如下。1  仪器与试剂1.1  仪器KQ5200DB型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；UV-755B紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。1.2  试剂95%乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR；三氯化铝AR；盐酸AR；氨水AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；乙酸镁A

10、R；甲醇AR；镁粉AR；正丁醇AR；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；双氧水AR；硫酸亚铁AR；水杨酸AR；新鲜一点红（采自广西百色市）。2  方法与结果2.1  总黄酮成分提取取新鲜一点红，烘干，粉碎。称取一点红粉末约6 g，加80 ml 95%乙醇，超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加80 ml 95 %乙醇，超声波提取2.5 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩57 ml左右为止，放置100 ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。2.2  测定方法依据以芦丁为对照品测定一点红中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化

11、合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。2.3  定量实验-总黄酮的含量测定2.3.1  波长的选择取样品液适量，在0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420700 nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510 nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。2.3.2  标准曲线的绘制分别精密吸取芦丁对照液（0.10 mg/ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10.00 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加10%

12、硝酸铝溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液4.00 ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂作空白参比液，于510 nm处测吸光度。吸光度测定结果见表1。表1  紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度结果（略）根据上表得回归方程：A=-0.031 1+13.518 4C，r=0.999 9。2.3.3  提取物含量的测定 精密吸取样品液0.50 ml，置10 ml容量瓶，按标准曲线的制备方法测定吸光度A=0.521，根据回归方程：A=-0.031 1+13.518 4C，计算样品中总黄酮的含量C=0.816 8 mg/ml。2.

13、3.4  回收实验精密量取样品液1.00 ml，加入标准芦丁对照品1.00 ml（0.10 mg/ml），同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为100%。2.4  定性实验-总黄酮的鉴别2.4.1  颜色反应紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%

14、乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1ml于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1次加入），在泡沫处呈紫红色。2.4.2  纸层析取样品溶液10l点在滤纸上。用正丁醇醋酸水=415（体积比）为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。2.5  总黄酮提取物对·OH清除作用参照Fenton反应的方法建立反应体系模型7，利用H202与Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。

15、反应式如下：H202+ Fe2+Fe3+·OH+OH-  。该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8.8 mmol/L H2O21 ml，9 mmol/L Fe2+l ml，9 mmol/L 1 ml水杨酸-乙醇溶液)加入一系列不同浓度的一点红总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在510 nm处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物(总黄酮)对·OH的清除作用，其清除率计算公式：清除率()= 

16、; AO-AA0×100%以实验的提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到50 ml分别测其对·OH的清除作用。从图1中可看出，一点红总黄酮提取液对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用，随着一点红总黄酮提取液浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。3  讨论实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为100%。利用本文所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄

17、酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。    黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等4。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。     黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调

18、节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用8，9。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。一点红分布广泛，本文实验结果表明，一点红中含有较为丰富的黄酮，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因此，一点红具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。    【参考文献】  1刘厚诚.一点红及其栽培技术J.长江蔬菜,2002,11：12.2陈航燕,卢海涛,余同珍.草药一点红治疗静脉炎197例临床观察J.广东药学院学报,2005,21(1):111.3李秀信,王荣花,杨秀萍,等.一点红黄酮成分的分析及含量测定J.西北植物学报,2003,23(4):671 .4夏杏洲,张 辉,魏传晚.榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究J.食