偏头痛风热证动物模型的建立_评价与药物反证_姚卓亭

1、35第13卷 第4期 2011 年 4 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 13 No. 4 Apr . ,2011偏头痛为神经内科临床常见的一种原发性疾病,反复发作,迁延难愈,可极大程度影响患者的生活质量并已造成全球范围的医疗经济负担。本病西医发病机制不明,多具有中枢神经系统敏化表现。偏头痛的中医病因多为风、火、痰、瘀、虚5种因素,本课题组前期针对19942005年中医药治疗偏头痛的文献进行了研究1,并将各方药按治法进行分类,统计各方药的治疗有效率,结果显示“散偏汤”治疗例数最多,有效率也较高,散偏汤主要治疗风热型头痛,兼有

2、疏肝理气之效,因此推断偏头痛临床证型以风热证型最多。本实验尝试建立偏头痛风热证动物模型,使用芎芷地龙汤进行表征反证,力图为偏头痛中药新药开发搭建真正符合中医药作用特点的评价体系和评价平台。1 材料与方法1.1 动物与分组清洁级SD 大鼠40只,体重150180g,由北京维通利华实验动物研究所提供,合格证号:SCXK(京2005-0005。适应性饲养3天后随机分为正常组(n =8、硝酸甘油组(n =8、风热组(n =8、风热硝酸甘油组(n =8、中药治疗组(n =85组,每组各8只。动物饲养的室内温度2127,相对湿度45%55%。各组大鼠喂常规饲料,自由进食饮水。1.2 药品实验所用的芎芷地龙

3、汤药用:川芎15g,白芷15g,生石膏(先下30g,地龙20g,元胡10g中饮片均购于北京中医药大学东方医院药房,自行按常规煎煮法煎煮并浓缩,每毫升含生药1.8g;氯化钠注射液500mL/袋,北京双鹤药业股份有限公司生产,批偏头痛风热证动物模型的建立、评价与药物反证姚卓亭1,王玉来2,赵永烈2,高颖3(1.人民卫生出版社,北京 100021;2.北京中医药大学东方医院,北京 100078;3.北京中医药大学东直门医院,北京 100700摘 要:目的:尝试建立偏头痛风热证动物模型。方法:使用热风及硝酸甘油协同诱导建立大鼠偏头痛风热证模型,通过图像采集、分析技术研究模型大鼠风热证生物表征(舌象、耳

4、廓、眼结膜的变化,并以芎芷地龙汤进行反证。结果:硝酸甘油组与风热硝酸甘油组舌灰度值与正常组有显著差异(P <0.01,中药治疗组与硝酸甘油组相比略有差异,无统计学意义(P >0.05;肉眼观察硝酸甘油组耳廓、眼结膜血管充血明显;热风因素在本实验中未对舌象、耳廓、眼结膜产生明显影响。结论:硝酸甘油皮下注射可引起生物体征(舌象、耳廓、眼结膜的改变,偏头痛风热证模型仍需进一步研究。关键词:风热证;偏头痛;硝酸甘油;证候模型中图分类号:R747.2 文献标识码:A 文章编号:1673-842X (2011 04- 0035- 03收稿日期:2010-10-04基金项目:教育部博士点新教师基

5、金课题(200800261023;北京中医药大学科研课题作者简介:姚卓亭(1984-,女,北京人,编辑,硕士,研究方向:中医脑病。通讯作者:赵永烈(1975-,男,山西大同人,主治医师,博士,研究方向:中医药治疗神经系统疾病的临床与实验研究。 E-mail:yongy3。Establishment Evaluation and Proof of a Novel Migraine AnimalModel Representing Wind-Heat SyndromeYAO Zhuo-ting 1,WANG Yu-lai 2,ZHAO Yong-lie 2,GAO Ying 3(1.People&

6、#39;s Medical Publishing House,Beijing 100021,China;2. Beijing University of TraditionalChinese Medicine Subsidiary Dongfang Hospital,Beijing 100078,China;3.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,ChinaAbstract:Objective :To try to establish a novel mi

7、graine animal model representing wind-heat syndrome. Method :Establishing rat model by having animals blew hot wind and GTN administration,taking pictures of rats' tongues,auricles and conjunctivae,analyzing the gray scale of rat tongues toevaluate the TCM syndrome and demonstrating the syndrome

8、 by Xiong Zhi Di Long Tang. Result :The gray scale level of tongue in GTN groups were significantly higher than control group(P <0.01;the gray scale level in medicated group was slightly lower than GTN groups(P >0.05. Observed by naked eyes,auricles and conjunctivae showed more blood vessel ne

9、twork than the control group. Wind-heat did notcause any significant difference between groups. Conclusion :GTN administration can cause changes in the manifestation of rat tongues,auricles and conjunctivae. The wind-heat syndrome model needs to be further considered to grow mature.Key words:wind-he

10、at syndrome;migraine;GTN;syndrome model辽宁中医药大学学报13卷号A200909154;硝酸甘油注射液5mg/mL,北京益民药业有限公司生产,批号20081025。1.3主要仪器电吹风 PHILIPS HP8200,佳能数码相机PowerShot A710,Image J 1.36b图像分析软件。1.4模型制备与药物干预实验第1日开始每日早晨固定时间予风热组、风热硝酸甘油组、中药治疗组电吹风吹热风,1档热度,风力1级,距离约45cm,温度控制于3941,连续吹风7日,第8日灌胃后30min予硝酸甘油组、风热硝酸甘油组、中药治疗组皮下注射硝酸甘油10mg/k

11、g,复制实验性偏头痛动物模型,正常组、风热组则皮下注射等量的生理盐水。实验第5日开始灌胃给药,连续4天,中药治疗组灌胃给芎芷地龙汤(10.8g/kg,其余组灌胃等量生理盐水。1.5指标观测(1动物喂养7日内的一般情况,包括活动情况、皮毛色泽、进食、大便性状。(2观察第8日皮下注射硝酸甘油或生理盐水后各组大鼠行为改变,并计大鼠搔头次数。(3皮下注射硝酸甘油或生理盐水4h后各组麻醉下进行舌象、耳廓、眼结膜图像采集。1.6舌象、耳廓、眼结膜图像采集各组在皮下注射硝酸甘油或生理盐水4h后给予1%戊巴比妥钠60mg/kg腹腔麻醉,将照相机固定在体视显微镜架上,将体视显微镜光源调到最大。麻醉大鼠置于镜架下

12、固定位置,用无齿镊夹住舌尖位置,平行于桌面轻拉出舌,进行照相,耳廓均取右耳耳背面拍照,以镊子辅助暴露下眼结膜;照相机置于手动模式,光圈8.0,快门1/100s,以体视镜架焦距螺旋调焦。1.7图像分析采用Image J 1.36b图像分析软件,操作步骤:打开Image J软件。打开要分析的图像。依次用鼠标选取舌体正中部和中部两侧大小为30×30的三处区域。每次选取后采用Edit中Invert处理所选区域。运行Analyze中的measure,出现舌质灰度值。1.8统计学处理应用SPSS16.0统计学软件进行数据处理,所有数据均用均数±标准差(x±s表示,对数据进行正

13、态分布检验和方差齐性检验,若两项检验均符合,使用单因素方差分析(One-way ANOVA统计,组间比较采用SNK检验,对不满足任一检验的数据,采用非参数检验中的多个独立样本Kruskal-Wallis H检验,组间比较采用Mann Whitney U法检验,均以P<0.05作为差异有统计学意义的界限。2 结 果2.1大鼠一般情况观察各组大鼠在饲养期间均毛发光洁整齐,食欲可,行动灵活敏捷。风热组、风热硝酸甘油组、中药治疗组在吹热风时均有部分大鼠出现烦躁、笼内站立、跳跃、鼻出血的情况。实验开始吹风处理前观察各组大鼠大便,多为软便、中等质地或偏硬质润,开始吹风后,风热组、风热硝酸甘油组、中药

14、治疗组大鼠大便无软便,少见中等质地,多为偏硬质润或干硬便,而正常组与硝酸甘油组以中等便及偏硬质润便为多。2.2复制偏头痛实验动物模型后行为变化2.2.1 一般改变硝酸甘油组、风热硝酸甘油组、中药治疗组皮下注射硝酸甘油后5min出现烦躁,活动增多,前肢及后肢频繁搔头,双耳耳廓血管较正常组增粗,且血管增长直抵耳缘,中药治疗组烦躁、搔头的表现较硝酸甘油组及风热硝酸甘油组少,3组在1h时基本安静蜷卧,其后间断活动,以蜷伏为主。注射硝酸甘油组的一般改变与文献描述相符2,说明硝酸甘油偏头痛模型复制成功。2.2.2 皮下注射后大鼠搔头次数计数以前肢搔脸1次计1次,后肢快速搔头动作从开始到停止计1次,人工观察

15、计算每只大鼠皮下注射后至2h的搔头次数,以判断实验模型复制是否成功。结果:正常组(13.13±3.66次,硝酸甘油组(78.25±12.8次,风热硝酸甘油组(87.00±10.78次,风热组(18.25±5.04次,中药治疗组(51.00±14.42次。统计后发现硝酸甘油组、风热硝酸甘油组、中药治疗组大鼠搔头次数高于正常组,且均有统计学意义(P<0.01;正常组、风热组、中药治疗组搔头次数低于硝酸甘油组,且均有统计学意义(P<0.01。风热组与正常组差异无统计学意义(P>0.05,风热硝酸甘油组与硝酸甘油组差异无统计学意义(P

16、>0.05。表1 各组2h内搔头次数(n=8,x±s组别 搔头次数正常组 13.13±3.66硝酸甘油组78.25±12.8#风热硝酸甘油组 87.00±10.78#风热组 18.25±5.04中药治疗组 51.00±14.42#注:与正常组比较:#P<0.01;与硝酸甘油组比较:P<0.01。2.3大鼠舌象灰度值比较肉眼观察正常组大鼠舌质淡红,余组颜色较正常组偏红,组间差异肉眼无法进行分辨。舌面灰度值结果:正常组85.05±9.79,硝酸甘油组97.35±6.53,风热硝酸甘油组98.82

17、77;8.94,风热组90.63±4.21,中药治疗组91.89±7.50。统计后发现硝酸甘油组、风热硝酸甘油组灰度值高于正常组,且均有统计学意义(P<0.05,风热组、中药治疗组灰度值高于正常组,低于硝酸甘油组与风热硝酸甘油组,但不具统计学意义(P>0.05,硝酸甘油组与风热硝酸甘油组组间无明显差异(P>0.05。表2 各组舌面灰度值的比较(n=8,x±s组别灰度值正常组85.05±9.79硝酸甘油组 97.35±6.53#风热硝酸甘油组 98.82±8.94#风热组90.63±4.21中药治疗组91.8

18、9±7.50注:与正常组比较:#P<0.05。2.4耳廓、眼结膜肉眼观察皮下注射硝酸甘油的硝酸甘油组、风热硝酸甘3613卷辽宁中医药大学学报油组、中药治疗组耳廓漫红,血管纹路明显,而正常组与风热组耳廓整体颜色较淡,脉络无其他3组明显。皮下注射硝酸甘油的硝酸甘油组、风热硝酸甘油组、中药治疗组下眼结膜血络充血明显,色红,而正常组与风热组眼结膜色淡红,无充血现象。3 讨 论(1偏头痛风热证模型的建立与评价。中医的“证”是疾病的病因、病位、病性、病机、邪正斗争等的概括,是动态变化的,具有整体性、复杂性、笼统性和模糊性等特性,是辨证论治的起点和核心。建立证候模型是研究中医证候学的重要途径

19、之一,也是现今中医科研的热点难点之一。中医证候模型是在中医整体观念及辨证施治思想指导下,运用脏象学说和病因病机理论,把人类疾病原型的某些特征在动物身上加以模拟复制而成,是中医学人体证候的具体再现3。中医证型动物模型可在中药新药开发中发挥重要作用,帮助搭建真正符合中医药作用特点的评价体系和评价平台,推进我国自主创新中药的发展。病证结合动物模型是证候动物模型发展的必然趋势4,而目前公认的思路是采取中医病因因素结合西医病理因素造模,并力求在动物的生物表征,如舌象、唇象、爪象、耳轮、尾尖、眼球、毛皮及动物行为等表现上模拟人的表征,并采用方药反证法加以验证,即遵循因-脉-证-治的思路5。目前中医风热证相

20、关动物模型均使用于上呼吸道感染及肺炎相关研究中,造模方法有化学药物致咳、致发热、致局部炎症等,这些造模方法均属按西医疾病机制建立模型,模拟病理变化,与中医传统病因意义的“风热证”差距很大,可以说,目前尚无符合中医病因病机理论的风热证动物模型。故本课题采用中医病因因素热风结合西医病理因素硝酸甘油联合建立偏头痛风热证动物模型,通过观察动物生物表征,如一般情况、舌象、耳廓、结膜来评价其与临床风热证证候的相似度,并使用祛风清热之芎芷地龙汤进行反证以确定模型的证属性。本研究造模思路符合中医理论及临床实际。本实验大鼠皮下注射硝酸甘油后行为改变符合文献描述2,统计搔头次数的结果发现搔头次数作为硝酸甘油偏头痛

21、动物模型行为学观察的评定指标具有可量化、客观的优点。同时表明芎芷地龙汤能明显改善偏头痛动物模型的行为学症状,减少动物的阳性反应次数,具有一定的镇痛镇静作用,符合课题组前期研究结论1。在舌象灰度值方面,本实验结果风热硝酸甘油组与硝酸甘油组、正常组与风热组舌象灰度值差异无统计学意义,即风热因素对于大鼠的影响在本实验中表现不明显。考虑可能由以下原因造成:(1硝酸甘油有扩血管作用,皮下注射硝酸甘油后动物活动增多,烦躁,且具有耳廓发红、结膜充血等表征,从中医理论角度可将硝酸甘油归为热性药,而硝酸甘油所造的模型可看做是一个热证模型,可能掩盖热风的造模因素对于动物的表征影响,这可能是风热硝酸甘油组与硝酸甘油

22、组舌象、耳廓、结膜差别不显著的原因。(2中医病因造模因素强度及稳定性可能不够,这可能是风热组较正常组无明显差异的主要原因。由于没有可借鉴的风热证模型,本实验造模属于探索性尝试,予大鼠连续吹热风7天,每天2h,并使用温度计监测控制笼内温度在3941。有几种因素可能导致造模因素效果不显著。电吹风影响范围局限。由于电吹风的风束以一定角度吹入笼中,客观上会导致笼内热量分配不均,温度计仅能固定监测笼内一点的温度,而大鼠会倾向于聚集在温度最低处,这客观上减弱了热风对于动物的影响。在课题经费及条件允许的情况下以后可考虑使用鼓风干燥箱或气候箱等设备进行造模以增加造模因素的稳定性。造模因素强度不够。本实验予大鼠吹热风7天,每天2h,影响强度可能不足,今后可尝试增加造模日数并采用每天间隔吹风2次的方法增加强度,具体条件需要进一步摸索。单因素造模影响强度不够。本实验在中医病因方面属单因素造模,给予热风外因,而临床一般认为偏头痛发病基础为气血虚弱,肝脏疏泄失常,加之感受风寒湿外邪发病,故肝失疏泄为偏头痛发生的重要内因。在造模中可考虑结合慢性情志应激与风热外袭两种病因因素,具体操作上可引入目前使用较多的慢性束缚应激模型,在造模过程中每日给予热风因素,双因素造模可同时模拟偏头痛发生的内外因,其对于大鼠表征的改变可能更为明显