多聚(二磷酸腺苷-核糖)聚合酶介导过氧亚硝基阴离子致豚鼠气道

1、    多聚(二磷酸腺苷-核糖)聚合酶介导过氧亚硝基 阴离子致豚鼠气道反应性增高的研究        摘要目的：探讨多聚(二磷酸腺苷-核糖)聚合酶(PARP)在ONOO-致豚鼠气管高反应性中的作用。方法：建立离体豚鼠气管条对组胺反应的浓度反应曲线，观察PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对过氧亚硝基阴离子(ONOO-)诱导豚鼠气管反应性变化的影响。结果：ONOO-(0.5 mmol/L)引起豚鼠气管上皮细胞明显受损，气管条对组胺的反应性及敏感性明显增高，3-A

2、B(1 mmol/L或5 mmol/L)逆转了ONOO-的上述作用；3-AB(5 mmol/L)本身对正常气管条收缩反应无明显影响。结论：PARP介导了ONOO-所引起的气道上皮细胞的损伤和气道高反应性的形成，提示通过抑制PARP的过度活化可为防治哮喘气道高反应性提供新策略。主题词聚腺苷酸聚合酶；阴离子；气道阻力中分类号R737.9文献标识码A文章编号1000-4718(2000)04-0337-05 Effect of poly(ADP-ribose) polymerase on the response of guinea pig tracheas induced by peroxynit

3、rite in vitroZHU Tie-nian, LING Yi-ling, ZHAO Rui-jing, GU Zhen-yong, LIU Man-ying(Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)Abstract AIM and METHODS: To elucidate the effect of poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) on tracheal hyperreactivity of guinea-pig indu

4、ced by peroxynitrite, the responses of guinea pig tracheas to histamine after incubation with peroxynitrite in the absence and presence of 3-aminobenzamide(3-AB), a highly selective inhibitor for PARP, were observed in vitro.RESULTS:The exposure of tracheal strips to peroxynitrite led to epithelial

5、damage and hyperreactivity to histamine, both of which were reversed by 3-AB(1 mmol/L or 5 mmol/L), whereas incubation of tracheal strips with 3-AB(5 mmol/L) had no effect on the reponses. CONCLUSION:PARP is involved in the epithelial damage and hyperreactivity of guinea-pig tracheas induced by pero

6、xynitrite. The results suggested that inhibition of excessive activation of PARP may represent a novel strategy for the prevention and therapy of airway hyperreactivity in asthma.MeSHPoly a polymerase; Anions;Airway resistance多聚(二磷酸腺苷-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)是一种核酸修复酶，由断裂的DNA活化，参与DNA

7、损伤的修复过程。当持续大量DNA损伤时，引起PARP过度活化，迅速大量耗竭其底物NAD+，增加ATP消耗，减少ATP生成，引起细胞功能障碍，甚至细胞死亡1。过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion, ONOO-)是一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O-)的快速反应产物，与NO和O-相比，ONOO-具有明显的氧化性，并能衍生多种其它氧化剂。有实验表明ONOO-对细胞的损伤作用主要是通过PARP途径引起2。气道反应性增高是支气管哮喘及其它气道炎症性疾病的重要特征之一。气道上皮细胞损伤是气道高反应性形成的主要原因3。有关支气管哮喘发病中气道上皮细胞ONOO-生成增多并引起气道反应性增高4

8、，5已有少量报道，而ONOO-损伤气道上皮细胞导致气道反应性增高的机制尚未见报道，本研究应用PARP阻断剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide, 3-AB)探讨PARP在ONOO-损伤气道上皮致气道高反应性中的作用，为防治哮喘气道高反应性提供新策略。材料和方法一、材料实验动物健康Dunkin-Hartly豚鼠18只，雌雄不拘，体重350450 g，由河北省实验动物中心提供。组胺、3-氨基苯甲酰胺购自Sigma公司，其它试剂均为国产分析纯。二、ONOO-的合成参照Beckman等6方法通过淬灭流动反应器(quenched-flow reactor)合成ONOO-，应用岛津UV-22

9、01紫外分光光度计测定波长302 nm时的ONOO-浓度，-80冰箱储存备用。三、实验分组健康豚鼠击头处死后，剖取气管，沿前正中线纵行切开，以每3个软骨环为一组横切制成气管条。实验分组(每组n=9):(1)ONOO-(0.50 mmol/L)组；(2)ONOO-(0.50 mmol/L)+3-AB 0.1 mmol/L组；(3)ONOO-(0.50 mmol/L)+3-AB 1 mmol/L组；(4)ONOO-(0.50 mmol/L)+3-AB 5 mmol/L组；(5) 溶剂对照组(与3-AB等体积的二甲基亚砜)；(6)3-AB 5 mmol/L组。四、实验过程将制备好的气管条悬挂于盛有6

10、 mL Krebs液浴槽中，37恒温，持续通95% O2和5% CO2的混和气体。MS-302多媒体化生物信号记录分析系统记录气管条张力变化。以0.1 mmol/L组胺预收缩气管条，于气管条恢复基础张力后，在浴槽中加入不同浓度的3-AB(以等体积的二甲基亚砜溶解)，孵育30 min后，再加入ONOO-避光孵育15 min，更换Krebs液，至肌条稳定后，用累积方法建立组胺累积浓度-反应曲线。五、电镜标本的留取以同样实验条件将豚鼠离体气管条放入浴槽中，取ONOO-组、ONOO-+3-AB(1 mmol/L)组及溶剂对照组各3条气管条，2.5%戊二醛固定制片，进行扫描电镜观察气道上皮细胞的形态学变

11、化。六、统计学处理累积浓度-反应曲线中，气管条的反应性以对不同浓度组胺的收缩反应占气管条对0.1 mmol/L组胺预收缩反应的百分比表示，气管条的最大收缩反应以Emax表示，气管条反应的敏感性以pD(-logEC50)表示，即气管条收缩达到50%时组胺浓度的负对数7。所有数据以均数±标准差(±s)表示，用t检验判定组间的差异显著性。结果一、ONOO-对豚鼠离体气管条反应性的影响0.50 mmol/L ONOO-组与溶剂对照组比较，气管条对各同一浓度组胺的反应均显著增高(P0.05，P0.01)，其最大收缩反应由溶剂对照组的101.2%±4.6%增高至128.0%&

12、#177;5.5%(P0.01)，气管条对组胺反应的敏感性(pD2)也明显高于溶剂对照组(P0.01)。(1A，表1)。Fig 1 Effect of 3-aminobenzamide(3-AB) on peroxynitrite-induced guinea-pig tracheal hyperreactivity to histamine*P0.05, *P0.01, *P0.001,vs vehicle group ；#P0.05, #P0.01, #P0.001, vs ONOO- group13-氨基苯甲酰胺对ONOO-致豚鼠气管高反应性的影响表13-氨基苯甲酰胺对ONOO-致豚鼠气

13、管条反应性(pD2, Emax)增高的影响Tab 1 Effect of 3-AB on increasing responses (pD，Emax) to histamine induced by peroxynitrite (ONOO-) in guinea-pig tracheal strips (±s, n=9)GrouppD2(-Logmol/L)Emax(%)Vehicle5.42±0.07101.2±4.63-AB(5 mmol/L)5.42±0.07100.2±1.7ONOO-(0.50 mmol/L)5.56±0.0

14、5*128.0±5.5*ONOO-+3-AB(0.1 mmol/L)5.48±0.11122.7±4.5ONOO-+3-AB(1 mmol/L)5.45±0.06#112.2±7.3#ONOO-+3-AB(5 mmol/L)5.43±0.10#106.0±11.7#*P0.01, vs vehicle group#P0.01, vs ONOO- group 二、PARP抑制剂对ONOO-所致气管反应性变化的影响3-AB(0.1 mmol/L)组气管条对各浓度组胺的反应性及敏感性(pD2)均低于ONOO-组，至1 mmol/L

15、 3-AB时气管条对各浓度组胺的反应性及敏感性均明显低于ONOO-组(P0.01)。当3-AB增至5 mmol/L时气管条的反应性及敏感性已降至接近溶剂对照组(1BD，表1)。3-AB(5 mmol/L)单独与气管条孵育，气管条对组胺的反应性及敏感性与溶剂对照组比较均无明显差异(1A，表1)。三、PARP抑制剂对ONOO-所致气道上皮细胞形态学变化的影响气管粘膜面扫描电镜显示：溶剂对照组气管粘膜面纤毛细胞规整，其间夹有杯状细胞，纤毛细胞游离面纤毛及杯状细胞表面微绒毛排列整齐(2A)；ONOO-组气管粘膜上皮细胞脱落，脱落的细胞可见细胞膜破裂，细胞核、细胞器及分泌颗粒等暴露(2B)；1 mmol

16、/L 3-AB组气管粘膜细胞损伤明显轻于ONOO-组(2C)。Fig 2 Damaging effect of peroxynitrite on tracheal epithelial cells of guinea-pig A: Tracheal epithelial cells in vehicle group, ×5 000; B: Tracheal epithelial cells treated with peroxynitrite, ×2 000; C: Tracheal epithelial cells in 1 mmol/L 3-AB group, 

17、5;2 0002过氧亚硝基阴离子对豚鼠气管上皮细胞损伤作用讨论早在本世纪50年代，Halfpenny 等就对ONOO-做了较系统的纯化学研究。ONOO-是NO和O- 迅速结合生成的，ONOO-与其质子化共轭酸ONOOH处于动态平衡，二者可泛称为过氧亚硝基，并能衍生多种氧化剂。1990年Beckman等首次提出ONOO-具有生物学作用6。随着对NO研究的逐步深入，已有不少研究发现ONOO-是NO产生损伤作用的主要环节。体外研究表明，ONOO-可调节血小板的功能，削弱大鼠离体血管的舒张功能，抑制型肺泡上皮细胞的代谢，破坏并减少肺泡表面活性物质的产生。在休克、缺血-再灌注损伤、败血症、肺纤维化及感染

18、性炎症等病理过程中，均证明有ONOO-的产生，其作用也愈来愈受到重视8。气道高反应性是哮喘发病的重要特征，气道上皮细胞损伤是哮喘气道高反应性形成的主要原因。作为气道结构细胞的气道上皮细胞既可作为效应细胞，产生和分泌各种炎症介质、细胞因子和氧自由基等，又是炎症介质的主要靶细胞9。Saleh等新近报道，在支气管哮喘病患者气道上皮及周围炎症细胞内有ONOO-的生成，并证明ONOO-生成量与哮喘患者的气道反应性呈正相关4。作者应用豚鼠哮喘模型也证实在哮喘发病过程中，气道上皮细胞及其周围炎细胞有ONOO-过量生成。Sadeghi-Hashjiin等应用ONOO-灌注离体豚鼠气管或整体气管内滴入ONOO-

19、，豚鼠气管对组胺的反应性明显提高5。本实验研究发现，用ONOO-与离体豚鼠气管条共同孵育后，气管条的反应性及敏感性均增高，同时电镜观察有气管上皮细胞损伤脱落，表明ONOO-参与并介导了气道上皮细胞损伤和气道高反应性的形成。气道上皮细胞受损后，其屏障功能丧失，气道粘膜下神经末梢暴露，使气道易于受刺激引起气道平滑肌收缩；气道上皮细胞功能受损妨碍其生成舒张气道平滑肌的介质和降解收缩气道平滑肌的介质，使气道反应性增高。目前认为ONOO-是较NO及O-氧化作用更强，作用更广泛的氧化剂。它生成后可在生成的局部、胞浆及弥散到邻近的细胞起反应10。线粒体是细胞的呼吸器官，在线粒体通过三羧酸循环及有氧磷酸化，保

20、证细胞的能量代谢。线粒体也是生成O-并形成ONOO-的主要部位11。ONOO-与核酸作用生成8-羟脱氧鸟嘌呤核苷或8-硝基鸟核苷酸等，导致核酸戊糖环脱氢，引起DNA裂解。裂解的DNA可激活PARP。PARP激活后利用辅酶(NAD+)生成多-ADP核糖，有助于DNA损伤的修复。但在DNA大量损伤时，PARP激活后将迅速、大量消耗辅酶(NAD+)，减慢糖酵解、电子传递和ATP生成的速率，并增加ATP的消耗。其结果是因细胞能量耗竭，造成细胞功能障碍，加速细胞的溶解与死亡2。3-AB为PARP的选择性抑制剂，本实验应用3-AB有效的抑制了因ONOO-导致的气道上皮细胞的损伤和气管反应性的增高，表明PA

21、RP介导了ONOO-所引起的气道上皮细胞的损伤和气道高反应性的形成。在DNA损伤修复通路中，除PARP途径外，还有多条有效的DNA损伤修复通路，PARP的过度活化对细胞或组织器官起到的主要是病理损伤作用。因此，开展针对抑制PARP活性的药物的研究，可为防治哮喘气道高反应性提供新策略。朱铁年（河北医科大学病理生理教研室， 河北 石家庄 050017）凌亦凌（河北医科大学病理生理教研室， 河北 石家庄 050017）赵瑞景（河北医科大学病理生理教研室， 河北 石家庄 050017）谷振勇（河北医科大学病理生理教研室， 河北 石家庄 050017）刘满英（河北医科大学病理生理教研室， 河北 石家庄

22、050017）参考文献1Ueta K, Hayashi O. ADP-ribosylationJ. Ann Rev Biochem, 1985, 54: 73100.2Szabo C, Zingarelli B, O'Connor M, et al. DNA strand breakage, activation of poly-ADP ribosyl synthetase and cellular energy depletion are involved in the cytotoxicity in macrophages and smooth muscle cells expos

23、ed to peroxynitriteJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93: 17531758.3Laitinen LA, Heino M, Laitinen A, et al.Damage of the airway epithelium and bronchial reactivity in patients with asthmaJ. Am Rev Respir Dis, 1985, 131: 599606.4Saleh D, Ernst P, Lim S, et al. Increased formation of the potent oxidant

24、peroxynitrite in the airways of asthmatic patients is associated with induction of nitric oxide synthase: effect of inhaled glucocorticoidJ. FASEB J, 1998, 12(11):929937.5Sadeghi-Hashjin G, Folkerts G, Henricks PAJ, et al. Peroxynitrite induces airway hyperresponsiveness in guinea pigs in vitro and

25、in vivoJ. Am J Respir Crit Care Med, 1996, 153: 16791701.6Beckman JS, Beckman TW, Chen J, et al. Apparent hydroxyl radial production by peroxynitrite: Implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxideJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87: 16201624.7Brink C, Duncan PG, Douglas JS. The response and sensitivity to h