稀土烟酸与8-羟基喹啉三元配合物对红酵母活性的影响

1、稀土和烟酸、8毛基喹啉三元配合物对红酵母活性的影响肖圣雄1张建军2胡吉林1陈双喜1綦鹏1王岳龙1江琼1（1湘南学院化学与生命科学系，湖南郴州423000 ;2河北师范大学实验中心，河北石 家庄 050016）摘要为探究配体烟酸（HL ）、8-羟基喹啉（Hhq）及其稀土配合物REL2hq2H2O （RE二La、Nd、Sm）对红酵母生物活性的影响，本 实验采用平板培养皿法和抑菌圈法。不同配合物及其配体的选择性抑 制能力通过抑菌圈直径的大小得到了充分的体现。比较分析数据之 后，我们发现相同的配合物对分离纯化得到的野生红酵母的抑菌能力 比实验红酵母强；同时，Sm的三元配合物对红酵母抑制作用最强， 因其

2、具有来源广泛、价格低廉、抑菌能力强等特点，初步推测可将这 些优势稀土配合物应用于有害红酵母的预防与防治之中，力求为人类 社会服务。关键词：稀土配合物；维生素；烟酸；8-羟基喹啉；红酵母；选择性抑制；抑菌圈Abstract: To study liga nd ni cot inic acid （HL）, 8 - hydroxyl quin oli ne （Hhq ） and its rare earth complexes REL2 hq 2H2O （ RE = La, Nd, Sm ） on Rhodotorula biological activity in vitro, this expe

3、riment adopts flat Petri dish method and bacteriostatic circle method. Different complexes and ligand selective inhibition ability through the bacteriostasis circle diameter has bee n fully reflected. A comparative an alysis of the data, we found the same complexes on the separation and purification

4、 of theWild基金项目 国家自然科学基金（21073053）,湖南省教育厅科研项目（11C1171）和湘南学院科研基金（2010Y061） 通讯作者：肖圣雄（1975-），男，湖南郴州人，湘南学院化学与生命科学系副教授，硕士，研究方向： 稀土配合物热化学及生物热化学。Rhodotorula bacteriostatic ability than the Experimental Rhodotorula; at the same time, three yuan of Sm complexes on Rhodotorula strongest inhibition, because of

5、 its wide source, low price, antibacterial capability is strong wait for a characteristic, speculated that the advantage rare earth complexes applied in prevention and control of harmful Rhodotorula, and strive to provide social services.Abstract: Keywords: rare earth ternary complex；Vitamin ； Nicot

6、inic acid； 8 - hydroxyl quinoline ； Rhodotorula； selective inhibition ； bacteriostatic circle.我国稀土含量丰富， 约占世界稀土资源总量的 80%，有很大的潜 在利用价值，充分利用好稀土资源至关重要。目前，稀土抑菌剂在各 个领域的应用还处于开发和发展阶段 1-3 。通过努力，人们已经发现 稀土具有抑菌作用，可用于研制新型的抗菌剂和抗菌材料 4以及稀土 具有独特的活性，能与具有特定的生理活性的配体形成稀土配合物， 有很好的抗菌、消炎、抗肿瘤的功效，并且稀土8-羟基喹啉 -烟酸具有杀菌作用 5。已证实稀土配

7、合物主要对微生物的细胞壁、生物膜、 蛋白质造成影响从而抑菌 6 ，我室最近的研究显示稀土配合物具有抗 细菌和抗真菌的作用 7 ，但是，稀土配合物对于真菌中的红酵母抑制 活性的研究在国内外都比较少。红酵母种类繁多，能发酵废糖蜜产生b-胡萝卜素8，而且一种粘红酵母还能产生脂肪以及丙氨酸、谷氨酸、 蛋氨酸等多类氨基酸。红酵母常存在于空气中，一些种类红酵母为致病菌，对周围环境适应能 力很强，容易对啤酒造成影响。它的污染渠道有很多，能够破坏木质 结构，对我们的家具造成危害。而且，胶红酵母能感染人引起的真菌 血症9，可经常寄宿于健康动物机体，构成机体正常菌群。正常条件 下不会引起机体感染，为条件致病性真菌

8、，多为内源性感染10。所以, 针对红酵母的生长抑制的研究具有重要的现实意义。因此，本文在稀土三元配合物对红酵母生长的抑制作用方面进行了探究，力求对有害红酵母的预防与防治有所帮助。1实验材料1.1指示菌野生红酵母（Wild Rhodotorula）通过分离纯化然后镜检得到， 实验红酵母（Experimental Rhodotorula购自陕西省微生物研究所。1.2试剂REL2 h q H2O （RE二La、Nd、Sm）配合物由实验前合成；二甲基亚砜（DMSO）,分析纯，重庆兴发金冠化工有限公司生产。1.3仪器及器材SW-CJ-2F超净工作台；LRH-60生化恒温培养箱（上海苏达）；HaierBC

9、D-2000型冰箱；立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50G ;GZX-DH.300-SBS电热恒温干燥箱； YP600型电子天平；800W电 炉；检测专用培养皿（内径 90 mm,高16-17 mm ）；接种环；玻耙； 微量进样器；1000 ul及100 ul移液枪、1000 ul及100 ul枪头；新华 1号滤纸；打孔器（直径 6 mm）；酒精灯；250 ml锥形瓶；移液管（5 ml ）；试管；标签纸；记号笔。1.4 培养基将300 g马铃薯削皮切块，加水煮沸30 min,过滤，滤液加入18 g 琼脂，葡萄糖20 g,酵母膏8 g,加水至1000 m煮沸后分装到试管中， 每个试管10 ml,

10、再于121 C高压灭菌30 min,灭菌完后将两根试管倾 斜放置，待冷却后即得斜面马铃薯培养基（nutient agar），其余的试 管直立放置冷却后即得高层马铃薯培养基（ nutient agar）。2 实验方法2.1 野生红酵母的分离与纯化2.1.1 采土样 :选择肥沃土壤，去表层土，挖5- 20 cm深度的土壤数10 g,装入已 灭菌的牛皮纸袋 ,封好袋口 ,带回实验室。2.1.2 制备土壤稀释液：称取土样1.0 g,放入盛99 ml无菌水的三角瓶中，置摇床振 荡20 min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2 ）。用100 移液枪 从中吸取100 Z土壤悬液，注入事先分装有900无菌水

11、的离心管中,吹吸 3 次,振荡均匀（ 10-3）。然后同样方法,配置成稀释 度为 10-4, 10-5 的土壤菌悬液2.1.3分离用一支新的无菌枪头,由低浓度开始,从各浓度土壤稀释液中各吸取100 L,对号较均匀地放入已写好稀释度的空白无菌平 皿中，然后在各平皿中加入已经融化并冷却到45 -50 C的马铃薯培养基（已灭菌） 12-15 ml ，将培养皿在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培养基混合均匀，直至培养基凝固。2.1.4 培养待平板上液体被完全吸收， 将平板倒置于28 C温箱中培养24h；2.1.5 观察发现菌苔颜色呈现珊瑚红到橙红或微带橘红色。表面可由光滑到褶皱，有光泽，

12、质地粘稠有时发硬，其横切面扁平到有较宽的凸起，边缘不规则到整齐，顶端常有较原始的假菌丝的特点，有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落。 将它接种到斜面培养基上培养即得野生红酵母。2.2 测试溶液的制备REL2hq2H2O （RE二La、Nd、Sm）及其配体准确称量之后，分别溶于 DMSO 溶液中，待充分溶解后，加入无菌三重蒸馏水配制成10 mmol L-1的母液，贮存于-20 C冰箱备用。2.3 实验滤纸片制备用直径为 6 mm 的打孔器制得圆形滤纸片，经过高温湿热灭菌后，用干燥箱烘干备用。2.4菌悬液的制备将野生红酵母与实验室红酵母菌种分别接种在 1.4 中制备的 斜面培养基

13、上于 28 C培养46 d充分活化后，加入10 mL无菌生 理盐水，用接种环刮取斜面培养基上的新鲜菌株，并充分振荡以分散菌体，备用。2.5检测平板的制备将1.4中的高层培养基用水域加热溶解后，在超净工作台上 迅速将它倒入到无菌专用培养皿内，待培养皿内水分干燥透时， 平板立刻进行抑菌实验。2.6抑菌实验261在超净工作台内，用移液管吸取一定浓度的菌悬液0.4 mL至2.5的平板上，用无菌玻耙涂布均匀。2.6.2用无菌镊子夹取 2.3制备的单片滤纸片，每平皿呈正三角形 摆放三片。2.6.3分别用微量进样器向每片滤纸片分别加10测试溶液，待测试溶液被滤纸片充分吸收后，倒转平皿30 min。2.6.4

14、转入生化恒温培养箱中28 C培养，24 h后测量抑菌圈直径。3抑菌效果经大量实验测试，不同的稀土三元化合物对红酵母的抑菌效果 如表所示：对野生红酵母的抑制作用如表一所示：Bacteriostatic cycle diameter / mmCompo undsFirstsec ondthirdfourthfifthsixth8 - hydroxyl quin oli ne15.2115.2915.3015.2315.2215.31NdL2hq 2H2O11.2011.2111.1911.1711.1511.23La L2hq 2H2O7.537.497.507.527.517.46Sm L2hq

15、 2H2O20.1120.1820.1620.1920.1120.10以上为6次实验数据，每个实验数据均由每次实验3个平皿抑菌圈直径的平均值对实验室红酵母的抑制作用如表二所示以上为6次实验数据，每个实验数据均由每次实验3个平皿抑菌圈直一Bacteriostatic cycle diameter/mmCompo undsFirstsecondthirdfourthfifthsixthNicoti nic acid HL一一一一一一8 - hydroxyl quin oli ne12.3312.2712.2512.3412.3112.29NdL2hq 2H2O10.5010.4710.4510.5

16、510.5010.53La L2hq 2H2O6.987.037.016.977.056.99Sm L2hq 2H2O17.0316.9717.0116.9917.0516.95径的平均值将表1平均值和表2平均值作比较，得到表3结果。表3继续培养前后抑菌圈直径平均值比较Compo undsMea ns of Table 1Mea ns of Table 2DifferenceNicoti nic acid HL一一一8 - hydroxyl quino li ne15.2612.302.96NdL2hq 2H2O11.1910.500.69La L2hq 2H2O7.507.000.50Sm

17、L2hq 2H2O20.1417.003.14由表3可得：稀土配合物具有较好的抑制红酵母的作用， 特别对野生红酵母的抑制效果明显，其中 Sm的配合物抑菌效果最强。4 分析与讨论4.1 抑菌效果分析当开始出现直径>7 mm勺抑菌圈时，则可认为抑菌现象出现。有 研究文献11表明在稀土配合物浓度为6 mmolL-1的时候，抑菌圈> 20 mm为强抑菌（S）;抑菌圈在10-20 mm之间，为中等抑菌（MS）; 抑菌圈v 10 mm为弱抑菌或不抑菌（R）。我们利用稀土配合物在 6 mmolL-1的浓度下测得抑菌圈直径大 小（La的配合物除外）均在10 mm以上，说明其具有较强的抑菌作 用，且

18、野生红酵母比实验室红酵母的抑菌圈直径都要大。 从而可以分 析出：稀土配合物具有较好的抑制红酵母的作用， 特别对野生红酵母 的抑制效果明显，其中 Sm 的配合物抑菌效果最强。4.2 抑菌机理初探细胞是生命结构和功能的基本单位，一切有机体都是由细胞构 成，。对细胞完整性的任何破坏，都会阻碍细胞完整生命活动的实现 12。作为本试验所用的指示真菌红酵母也不例外。现通过论述稀土配合物对细胞的细胞壁和细胞膜的影响来探讨 其抑菌机理。红酵母细胞壁主要由葡聚糖、 甘露糖、糖蛋白和几丁质 4 种成分 组成，还含有微量的糖原质、海藻糖、戊糖、核酸、脂质等成分。一 方面，高浓度（指杀菌浓度和抑菌浓度）Nd3+可断裂

19、细胞壁中肽聚糖的 N-乙酰葡糖胺大部分肽键，Nd与肽键断裂后游离氨基中的氮原子有 直接的键合作用; Nd 使氢键断裂，破坏肽聚糖的立体结构而几丁质的结构为 伕聚-N-乙酰葡糖胺冋，由此可见，一定浓度的Nd'+可使红酵母细胞壁中几丁质的 怜聚-N-乙酰葡糖胺的结构遭到破坏， 结构 变得稀疏， 网孔增大。 导致细胞壁通透性增大。另一方面，干扰真菌 细胞壁的麦角固醇的生物合成， 影响真菌的脂质代谢， 使真菌细胞损 伤或死亡而起到杀菌和抑菌作用。红酵母的细胞膜成分主要是蛋白质、 类脂和少量糖类。 稀土元素 原子外层有空轨道 ,可接受孤对电子形成配位键 , 而真菌中蛋白质含 有氮、氧等原子 ,

20、具有供电子能力 , 二者之间可形成稳定的配位键而 使真菌失去活性 14。稀土配合物的分子量和共轭效应增强， 能形成稳 定的荷电配合物， 对细胞磷脂和肽链上的羧基有较强的亲和力， 能稳 定结合在富含蛋白质的细胞膜及溶酶体上， 从而抑制溶体酶释放炎症 物质，同时稀土配合物抑制酶或酶原的活性 15从而阻碍真菌细胞膜蛋 白质的合成，或者阻碍合成的异常蛋白质释放。一方面可以与菌(特别是金黄色葡萄球菌 )的转移核糖核酸 ( tRNA ) 中的磷酰基键合 16,抑制了其核酸酶的活性及功能 , 从而使细菌的生长受到抑制 ; 另一方 面, 由于形成配合物后 , 配合物的分子量和共轭效应都增强 , 脂溶性 增强,

21、 对细胞膜的穿透或破坏能力增强 , 使生物体生长和代谢需要的 关键成分流失 , 导致生物体不能完成正常的运转 17。研究表明，稀土 离子无论性质或结构均与 。32+很相似，不同之处在于稀土离子的电荷 高于Ca2+，因而离子势大，对以离子键为主的化合物，稀土离子的结 合稳定性要高于Ca2+,它不但可以占据Ca2+的结合位点，还可以取 代Ca2+，且具有很强的结合力，导致生物大分子降低或失去活性18-19使细胞代谢的有序性和自控性失调，达到抑制细菌繁殖的目的。由以上可得出结论，稀土配合物抑制红酵母的生长机理是： 由于 稀土配合物能够破坏红酵母的细胞壁与细胞膜结构，使细胞壁失去保 护功能，细胞膜丧失

22、选择透过性机制，导致细胞内部稳态发生改变， 某些酶促反应受到影响，正常的生理代谢紊乱。4.3市场分析与讨论平板滤纸抑菌法，具有操作简便、结果直观易懂等优点，我们充分利用这一优点进行实验来探究稀土配合物及其配体对红酵母生长活性抑制作用，结合红酵母自身特殊形态特征，得出一系列可取性的 实验结果。我国的稀土资源十分丰富，被国家列为实行保护性开采的战略资 源，居世界的首位。为了能推广普及抑菌持久的稀土配合物以及系列 产品，就目前中国稀土市场稀土价格及其含量进行了比较，如表4所示:表4 稀土（镧系元素）价格20物质纯度价格（元/千克）产地地壳中的质量分数%氧化钕99.0-99.9%110112.5中国0

23、.00239氧化钐> 99.5%9 9.5中国0.00647氧化铕99.9-99.99%29503000中国0.000106氧化钦99.0-99.9%26002700澳大利亚0.000115从表4可以得出：Sm在含量和价格上占据很强的优势，这在实验研究和工业生产方面有很大的应用前景。5结论以上实验证明稀土配合物 REL2 hq 2H2O （RE二La、Nd、Sm）以及配体烟酸、 8-羟基喹啉对红酵母均有抑制作用。通过测量抑菌圈的大小，发现不同配体合成的配合物对红酵母的生长存在选择性抑制，Sm 的配合物抑菌效果最强且 Sm 在中国稀土市场上具有含量丰富、 价格低廉等特点， 从市场经济角度考

24、虑， 在实验研究和工业生产方面 有更大的优势。初步推测可将这种稀土配合物应用于有害红酵母的预 防与防治，为人类社会做贡献。有关稀土配合物抑菌机制的持久性以及对人体生理机能影响方 面有待进一步研究。 目前采用的灭菌方法都是对红酵母菌体而言， 但 是对于芽孢的新型、特效抑菌剂的研究也有待进一步探讨。参考文献1 张金超 , 杨梦苏 . 稀土配合物药物研究进展 J. 稀有金属 , 2005, 29(6): 916-9202 项楠, 张雪梅 , 田莉瑛, 赵宝华. 稀土及其配合物在生物医学上 的研究进展 J. 生物学杂志 , 2009, 8(26): 439-4423 纪云晶 , 王宗惠, 栗建林, 彭

25、少华 . 稀土与肿瘤关系的探讨 J. 卫 生毒理学杂志 , 1994, 8(3): 164-1704 Zhang Hui, Feng Jia. Wang He.Baeteriostatic effects of cerium-humic acid complex-An experimental studyJ. Biologica Trace Element Research. 2000, 73(1): 29-365 梁福沛, 唐献兰, 胡瑞祥, 蒙衍强, 潘恩霆. 稀土8-羟基喹啉-烟 酸三元配合物合成、表征及其抑菌活性 J. 稀有金属 , 2000, 24(4): 265-2696 杨楠,

26、张雪梅 , 田莉瑛 , 赵宝华. 稀土及其配合物抑菌机理的研 究进展 J. 应用化工 , 2008, 37(11): 1362-13677 何笃贵, 李强国, 杨德俊, 李旭, 叶丽娟, 魏德良, 黄熠, 张辉, 刘义.RE(C7H5O3)2(C9H6NO)配合物抗真菌作用的热动力学研究J.中 国稀土学报 , 2007, 25(1): 107-1108 徐立强，张军芳，许新军，王卫红，李艾，孙兰芳，窦瑞娟，王 松松.红酵母发酵废糖蜜生产B -胡萝卜素研究J.中国中部地区农 产品加工产学研研究会论文集 , 20079 朱敏, 李莉, 章强强, 赵颖, 朱均昊. 胶红酵母致真菌血症 1 例：临床及实验研究 J. 中国真菌学杂志 , 2009, 4(4): 207-21010 金艺鹏 , 林德贵. 犬下泌尿道深红酵母菌感染 J. 中国兽医杂志 , 2004, 40(5): 3811 王学智, 郑利民 . 稀土与含氮中性配体配合物的合成、表征及抗 菌作用 J. 稀土化学报 , 2003:14-1612 翟中和 , 王喜忠 , 丁明孝 . 细胞生物