O-GlcNAc修饰在谷氨酰胺诱导热休克蛋白表达中作用研究

1、谷氨酰胺通过 O-GlcNAc 修饰机制诱导热休克蛋白表达东南大学附属中大医院 210009龚俊松，景亮【摘要】目的：本研究观察谷氨酰胺Gin诱导热休克蛋白70 HSP70表达对脂 多糖LPS刺激乳鼠心肌细胞的保护作用及氧连 -N-乙酰葡萄糖胺0-GlcNAc 修饰在Gin诱导HSP70表达信号转导通路中的作用。 方法：原代培养SD乳鼠 心肌细胞后依据培养基内参加成分分五组：对照组 C 组给予双蒸水； LPS 组LPS 4ug/ml ； GL 组Gin 5mM +LPS 4ug/ml ； GLA 组Gin 5mM+LPS 4ug/ml+Alloxan 1mM, Alloxan为O连-N-乙酰葡

2、萄糖胺氨基转移酶OGT抑制剂， 能减少 O-GlcNAc 修饰水平；GLP 组Gln 5mM+LPS 4ug/ml+PUGNAc 100uM, PUGNAc为O-连N-乙酰葡萄糖苷酶OGA抑制剂，能增加O-GlcNAc修饰水平。 上述 5 组细胞孵育 6h 后，以台盼蓝拒染法测定细胞生存率；比色法测定细胞培 养液 LDH 水平反映心肌细胞损伤情况 ； Western Blotting 分析心肌细胞 HSP70 蛋白水平、胞核热休克因子-1 HSF-1蛋白水平和O-GlcNAc修饰水平；电泳 迁徙率变动实验electrophoretic mobility shift assay EMSA 测定心

3、肌细胞核 HSF-1 转录活性。结果：各组细胞生存率无显著性变化。 结果： 与 C 组相比， LPS组细胞损伤显著增加pv.05,但在Gin+LPS组这种心肌细胞损伤得到明显 恢复pv.05。与C组相比，LPS组的心肌细胞O-GlcNAc修饰水平、HSP70蛋 白表达、胞核 HSF-1 蛋白表达及转录活性，明显增加 p<.05； Gln+LPS 组的 O-GlcNAc修饰水平、HSP70蛋白表达、胞核HSF-1蛋白表达及转录活性与 LPS 组相比更进一步增加pv.05。Gin在LPS刺激心肌细胞的上述作用可为 Alloxan 完全抑制GLA组，同时也可为PUGNAc所逆转GLP组。结论：

4、LPS刺激 乳鼠心肌细胞给予Gin治疗，可通过增加O-GIcNAc修饰水平，增加核内转录因 子HSF-1水平及转录活性，进而促进 HSP70的蛋白表达。增强O连-N-乙酰葡 萄糖胺氨基转移酶和O-连N-乙酰葡萄糖苷酶活性可能是脓毒血症治疗的另一潜 在治疗学靶点。【关键词】 谷氨酰胺、O-GIcNAc修饰、HSP70 HSF-1【AbstractAIMS: To investigate the protective effect of glutamine-induced heat shock proteins(HSP) expression in LPS-treated rat cardiocy

5、tes and whether its possible molecular mechanisms are relative to enzyme activities of O-linked 3-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification pathway.METHODS: Primary cultures of neon atal rat cardiocytes were divided in to con trol (treated with double distilled water), LPS (lipopolysaccharide, 4 卩

6、 g/ml),Gln+LPS (Gln 5mM+LPS 4 卩 g/ml),Gln+LPS+Alloxa n(an inhibitor of O-linked 0N-acetyl glucosamine transferase/OGT, 1mM), and Gin+LPS+PUGNAc (an inhibitor of O-linked &N-acetyl glucosaminidase/OGA, 1 卩 M ) groups. Aften6 incubation, cell viability was measured by Trypa n blue exclusi on metho

7、d and cell n ecrosis was assessed by detect ing the release of lactate dehydroge nase(LDH) in culture medium in all groups, respectively. The levels of HSP70 expression, endonuclear heat shock factor 1(HSF-1) expression, and O-GlcNAc modification from cardiocytes were analyzed by Western blotting. H

8、SF-1 transcriptional activity of cardiocytes was determined by electrophoretic mobility shift assay ( EMSA) in all groups, respectively. Data were presented as meanstandard deviation. Statistical analysis were performed using one-way ANOVA. Statistical significance was assigned at a P value of less

9、than 0.05.RESULTS: There were no significant differences in cell viability among five groups. LDH levels in culture medium were low in the control group but markedly increased in the LPS group (P<0.05). Treatment with Gln (Gln+LPS group) significantly decreasedLPS-induced cardiocytes damage (P<

10、;0.05), and this protective action by Gln could be mimicked with PUGNAc (in Gln+LPS+PUGNAc group) or banished with alloxan (in Gln+LPS+Alloxan group). HSP 70 levels, endonuclear HSF-1 levels, O-GlcNAc modification levels, and HSF-1 transcriptional activity from cardiocytes were significantly increas

11、ed in the LPS group compared with control group. Treatment with Gln (Gln+LPS group) further increased HSP70 levels, endonuclear HSF-1 levels, O-GlcNAc modification levels and HSF-1 transcriptional activity in cardiocytes (P<0.05). The above-mentioned action by Gln also could be mimicked with PUGN

12、Ac (in Gln+LPS+PUGNAc group) or banished with alloxan (in Gln+LPS+Alloxan group) .CONCLUSION: Glutamine induces HSP expression and protects against LPS-induced necrosis in rat cardiocytes. The molecular mechanism of Gln-mediated HSP70 expression appearsto be dependent on the enzyme activities of O-G

13、lcNAc pathway and that augmentation of enzyme activities may have potential therapeutic effects in sepsis.【 Key words】Glutamine,O-GlcNAc modification, Heat shock protein 70,Heat shock factor-1谷氨酰胺 (glutamine，Gln) 是人血中含量最丰富的一种氨基酸， 约占体内总游 离氨基酸的50%。Gin作为蛋白质和肽的组分，在参与机体新陈代谢，维持机体 酸碱平衡，调控机体免疫机能，保护细胞及脏器功能等方

14、面发挥了重要作用， 被称为“条件必需氨基酸 11。热休克蛋白(heat shock protein , HSP)是体内具有 高度保守性的一类蛋白质，研究发现Gln能诱导HSP表达【2】【3】，我们前期研究 也说明， Gin 能增加休克大鼠的 HSP70 表达，减少炎症因子的释放，改善血管 反响性【4】，但是机制未明。蛋白质氧连-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc )修饰是一种发生在细胞浆、细胞 核内的糖基化方式，它是一种广泛的、动态的翻译后修饰现象，通过 O 位糖苷 键将单个N-乙酰氨基葡萄糖连接到丝氨酸或苏氨酸的羟基上 5。在O-GlcNAc 修饰过程中，OGT(N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶)

15、负责在裸露蛋白丝氨酸或苏氨 酸的羟基上加上O位糖基，Alloxon为OGT酶抑制剂【6】；OGA (N-乙酰葡萄糖 胺糖苷酶，O-GlcNAcase)负责将O位糖基移除，PUGNAc为OGA酶抑制剂【7】。 在应激时， O 位糖基化能敏感地感受外界环境的变化，调节蛋白质的相互作用， 在细胞信号转导、基因转录、翻译、细胞周期、应激及多种疾病中起重要调控 作用【8】。我们假设 LPS 刺激乳鼠原代心肌细胞给予 Gln 后能对细胞的 O-GlcNAc 修 饰水平产生影响，并对HSP转录因子热休克转录因子1( HSF-1)产生影响，进 而影响HSP基因的表达，产生相应生物学效应。材料和方法： 本实验涉

16、及心肌细胞原代培养，需要使用新生乳鼠，实验经过东南大学动 物伦理委员会的批准，严格执行动物保护相关条例。1. 心肌细胞培养：出生 48h 的 SD 乳鼠(东南大学动物中心) ，取心脏用酶消化法制备心肌细 胞单细胞悬液，以差速贴壁法别离纯化心肌细胞，参加含10%小牛血清(杭州四季青)的高糖型 MDEM (GIBCO)培养液，按3*106个细胞/瓶接种于50ml 培养瓶(Corni ng, USA),置于37C含5%CO2培养箱中孵育，约3-4天后细胞 至对数生长期，到达 80%融合，并出现明显的搏动现象，开始给予干预措施。 实验分5组，C组、L组、GL组、GLA组、GLP组，分别给与双蒸水 50

17、ul、Gin (Amersham) 5mM、LPS( sigma) 4 血/ml、Gln 5mM+ LPS 4 血/ml、Gln 5mM+ LPS 4 血/ml +Alloxan 1mM , Gln 5mM+ LPS 4 血/ml +PUGNAc 100uM。继续培养 6h 后测定相关指标,并提取细胞蛋白。2. 心肌细胞生存率测定和细胞培养液 LDH 活力测定：用台盼蓝拒染法测定上述各组干预后 6h心肌细胞生存率，取10ul细胞悬液 混合混合 0.04%台盼蓝染色液, 计数至少 200个细胞计算细胞生存率。 心肌细胞 坏死时能释放 LDH ,故通过测定细胞培养液 LDH 含量能一定程度反响细胞

18、坏死 情况,使用 LDH 试剂盒(南京建成)以比色法测定相关数据,依据说明书公式 计算出各组细胞培养液 LDH 活力。3. Western Blotting 法测定干预后 6h HSP70 HSF-1、O-GlcNAc 蛋白含量水平：3.1以各组细胞HSP70水平为例，细胞干预后6h使用细胞裂解液(P0013, Beyotime)于冰上裂解心肌细胞，高速离心取上清获得细胞总蛋白。HSP70的测定采用变性SDS-PAGE法，各组样品加于事先制备好的 SDS-PAGE凝胶，上 层胶浓度5%,80V电压通电约30min，下层胶浓度8%, 120V电压通电约60min 以别离蛋白。以半干转膜仪将凝胶上

19、蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶(光明牌，上海)封闭1h, 4C下1： 5000 HSP70小鼠单克隆抗体(ab5442, abcam, American孵育过夜，用PBST洗膜约10min*3-5次，1: 5000含辣根过氧化物 酶的二抗孵育1h,用PBST洗膜约10min*3-5次,ECL法与含蛋白及抗体的PVDF 膜反响，暗室压片曝光，洗出胶片。3.2细胞核内HSF-1蛋白的测量先用细胞核、细胞浆蛋白提取试剂盒P0027, Beyotime提取心肌细胞核蛋白，后续过程与HSP70的测定相似。其一抗为大鼠HSF-1单克隆抗体ab19913, abeam, American,二抗为辣根过氧

20、化物酶标 记山羊抗大鼠IgGH+LZB2307,北京中山金桥。3.30-GlcNAc蛋白水平测定采用非变性 SDS-PAGE法电泳别离蛋白，上层 胶浓度5%，下层胶浓度6%，其余步骤与HSP70水平测定相似。其一抗为小鼠 单克隆抗O-GlcNAc CTD110.6，abeam, American，二抗为辣根过氧化物酶标 记山羊抗小鼠IgG H+LZB2305,北京中杉金桥。3.4内参选用抗Tubulin小鼠单克隆抗体AT819，Beyotime，具体测量方 法与HSP70 致。所有实验至少重复三遍以上，各组实验得到的胶片用成像系统 Labworks， America n进行拍照，并采用 tot

21、allab2.0 Phoretix In ter natio nal，En gla nd 软 件进行分析。4. 电泳迁移率变动实验 Electrophoretic mobility shift assay ， EMSA：该方法用来测定 HSF-1 这一转录因子与其特定 HSE 序列的结合活性。 HSE 探针采用如下序列 GCCTCGATTGTTCGCGAAGTTTCG 上海生工生物公司合 成。同位素使用-32PATP 5,000Ci/mmol at 10mCi/ml北京双源，EMSA 步 骤按照EMSA/Gel-Shift试剂盒Beyotime说明书进行，依次进行标记探针， 配置 EMSA 胶

22、， EMSA 结合反响等步骤。以 0.5XTBE 作为电泳液进行电泳， 所得凝胶紧贴胶片，于-80C曝光24-72h，洗片并用成像系统拍照，totallab2.0(Phoretix In ter natio nal, En gla nd) 软件进行分析，通过比拟各组条带灰度值 HSF-1转录活性。5统计学分析：所有数据均以均值一标准差(xs)表示，组间数据采用SPSS 15.0软件(SPSS inc Chicago)行单因素方差分析，采用 Prism4.0软件(GraphPad software, San Diego)作图，Pv 0.05有统计学意义。结果:1.各组细胞不同干预后6h细胞生存率

23、及培养液LDH活力变化(=?m Ha100-8 7 353210 o o 9 9 9 9 & 9 9 9 9LGL2000*15001000*500-Fig! 各组心肌細胞生存率及細胞培养液LDH活力. 谷氨St胺显著減少LPS造成的心肌细胞1DH釋放梆这 种作用可被Al loxan削弱或被PUGNAc模拟。* PV 0. 05 vs G组：$ PV0. 05 vs L组：# PV0. 05 vs GL组口C=controlL=LPSGLA=Gln+LPS+Alioxar»GLP=Gln+LPS+PUGNAcrnmn GL=Gln+LPS各组心肌细胞干预后 6h 生存率无统计

24、学差异。细胞培养液 LDH 活力在一 定程度上能反映心肌细胞的坏死情况。从 Fig1 可以看出，与 C 组相比，其余四 组L组、GL组、GLA组、GLP组心肌细胞培养液LDH活力明显增高Pv0.05 , *表示；与L组相比，Gln能减少心肌细胞LDH释放GL组，Pv0.05, $表 示。与 GL 组相比， Alloxan 能使细胞培养液 LDH 活力显著增高 GLA 组， P v 0.05 , #表示。2.Gln增强LPS刺激心肌细胞HSP70蛋白表达水平、胞核 HSF-1水平及转录活 性、 O-GlcNAc 修饰水平。从图Fig2A中可以看出，同C组相比，L、GL组HSP70的表达水平都有不

25、 同程度的提高Pv 0.05，以*表示。与L组相比，Gln能显著提高HSP70的蛋 白表达水平GL组，Pv 0.05 ,以$表示。为了弄清该机制，我们研究了 HSP70 的转录因子HSF-1的表达情况。本实验HSP70的表达水平与心肌细胞核 HSF-1 水平及转录活性有关。与 C组相比，L、GL组胞核HSF-1水平Fig2B及转 录活性Fig2C不同程度提高Pv 0.05，以*表示。与L组相比，GL组胞核 HSF-1水平及转录活性增强Pv 0.05，以$表示。图 Fig2D 反映心肌细胞 O-GlcNAc 修饰水平,图中从低分子量到高分子量 蛋白中许多蛋白质都存在 O-GlcNAc 修饰现象,

26、 故整张胶片上出现多处条带。 将 整张胶片取五处样,分别测定灰度值,相加后再予以标化来说明每组的 O-GlcNAc 修饰水平。 与 C 组相比, L 组及 GL 组的 O 位糖基化修饰水平都有不 同程度的升高。与 L 组相比, GL 组 O-GlcNAc 蛋白表达水平进一步提高 Pv 0.05，以$表示。上述结果与干预后HSP70蛋白水平的变化趋势保持一致，这 一点似乎暗示O-GIcNAc修饰水平与HSP70的表达水平具有某种联系。3.Alloxan、PUGNAc干预后各组细胞 O-GIcNAc、HSP70蛋白水平及胞核 HSF-1 蛋白表达水平为了进一步探讨O-GIcNAc修饰在Gln诱导H

27、SP70表达机制中的作用，我 们在GL组的根底上运用了对O-GIcNAc糖基化关键酶产生作用的药物 Alloxan、 PUGNAc。其中Alloxan为OGT酶抑制剂，PUGNAc为OGA酶抑制剂。从Fig2D 可以看出，在给予Alloxan后心肌细胞O-GIcNAc修饰水平显著减少Pv0.05, 以#表示，在给予PUGNAc后O-GIcNAc修饰水平显著提高Pv 0.05，以#表 示。与此同时，心肌细胞核 HSF-1水平Fig2B及转录活性Fig2C在给予 O-GlcNAc 糖基化关键酶抑制剂后也发生变化,给予 Alloxan 后,心肌细胞核内 HSF-1表达水平降低，转录活性降低Pv 0.

28、05，以#表示；给予PUGNAc后心 肌细胞胞核 HSF-1 水平增高,转录活性提高,其差异有统计学意义Pv0.05,以#表示。HSP70的变化趋势Fig2A与心肌细胞核内 HSF-1表达水平Fig2B 一致，GLA组HSP70水平明显减低，GLP组HSP70水平明显升高，其差异有 统计学意义Pv 0.05，以#表示。A. WesiHTi blotC. IMSAIectroprecic moblllly shift assay) 0. Western blcitoP7HsB. wntem bbt* -f liuln宀 rjjszwsQnLL* 口卜丄曲工一-< utmdnh'J7

29、UUG 工D-GIcMAc* ttFree probe15Fig琏韓昶玉酗心刖獭腳咙財罕,牖H时秤AfitO (C)、 0砒臥翳水平CD) *可劭搠临胡瞬我PUGIWli拟.*pC俪viCr I p<C.05viLS,柿GMwG逸遞 Owntral Qttl GLIntLfSd GLPIntLPS<-PUGNAe乏 L'LFS Q GLft»GlrH4_PS*Alloxan7.5M0'-旳卩2.5f1DT-XGL GLArn<2 u-nri-qnJLJ* it0Tubulin讨论：热休克反响作为生物界普遍存在的保护机制，越来越受到研究者的关注。我们前

30、期的工作说明，休克状态下， Gin能诱导HSP70表达，产生炎症因子， 改善血管反响性【4】。Gin作为一种平安、有效的热休克蛋白表达诱导剂已成为学 术界的共识【2】【4】，但是具体机制未明。本实验各组细胞生存率都在 95%以上，经统计学分析无显著性差异，一方面说明本实验心肌细胞并无明显死亡，另一方面也说明干预药物Alloxan、PUGNAc的浓度相对平安。LDH是重要的心肌细胞酶，心肌细胞坏死时，LDH释放到细胞培养液中，故测定心肌细胞培养液LDH活力能在一定程度上反响心 肌细胞坏死情况。本实验中，LPS可造成严重心肌细胞损伤。同时给予Gin、LPS 能一定程度逆转LPS造成的LDH释放。说

31、明Gin对LPS刺激心肌细胞有一定 保护作用，这可能与Gin诱导HSP70表达有一定的联系。HSP70作为一种保护 性蛋白，对心肌细胞的生存状态起到一定的改善。GL组HSP70水平提升幅度较L组高，说明Gin能进一步诱发LPS刺激下心肌细胞的HSP70表达，发挥HSP70 对心肌细胞的保护作用， 这一结果与先前我科的实验结果及 Sanders【 3】等人研究 果蝇 Kc 细胞时的发现是一致的。并且高水平的 HSP70 能一定程度减轻细胞损 伤，减少 LDH 释放。在此根底上，我们进一步证实， HSP70 表达的增多与其关 键转录因子 HSF-1 表达水平有关。HSF-1是HSP70的重要转录因

32、子，目前研究显示HSP在转录水平主要依靠 HSF-1 调节【8】。正常情况下， HSF-1 以无活性的单体形式在细胞浆呈泛素化状态， 应激后，游离的 HSF-1 单体增多，这些游离的 HSF-1 单体入核形成三聚体，磷 酸化，进而活性增强，与HSP基因转录必须的核苷酸序列 HSE结合，促进HSP 基因的转录表达【9】。本文以HSF-1作为桥梁来研究Gin在诱导HSP70表达机制 中的地位。通过分析实验结果， 给予 Gln 能增加心肌细胞核 HSF-1 的表达水平， 增强HSF-1转录活性，进而启动HSP70的转录翻译。心肌细胞胞核内HSF-1水 平和HSF-1活性从某种程度上决定了 HSP70

33、的表达水平。最近研究发现，Gin能提高己糖胺合成途径HBP终产物UDP-GIcNAc 的含量， 此物质同时也是 O-GicNAc 修饰的底物， 能为 O-GicNAc 修饰提供糖基 【10】。 O-GicNAc 修饰修饰的增多进而影响相关信号转导通路，并发挥相应生物 学功能。 O-GicNAc 修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种重要形式，可作为细胞的 “营养感受器和“应激感受器【11】，调节细胞、蛋白、转录因子的功能及活性。 从Fig2D中可以看出，Gin可以提高LPS刺激心肌细胞O-GIcNAc修饰水平，这 与 HSF-1 及 HSP70 水平的变化趋势一致。上述结果提示 Gin 有可能通过 H

34、BP 途径，增加 O-GicNAc 修饰的底物 UDP-GicNAc 的含量，为 O-GicNAc 修饰提 供糖基，从而增加 O-GicNAc 修饰水平。近来有文章报道 O-GicNAc 修饰对 SP1、 NF启、C-Jun等转录因子活性起到明显作用11。因而我们推测 Gin可能通过 O-GicNAc 修饰这一感受器来影响转录因子 HSF-1 的含量或转录活性， 进而影响HSP70的表达。为了验证上述推测，我们使用了两个干预 O-GlcNAc 修饰关键酶的抑制剂：OGT酶抑制剂Alloxan和OGA酶抑制剂PUGNAc。作为OGT酶抑制剂，Alloxan 可降低 O-GlcNAc 修饰水平 G

35、LA 组，并减少心肌细胞核内 HSF-1 水平及转录 活性，减少HSP70的蛋白水平，增加心肌细胞损伤。使用OGA酶抑制剂PUGNAc 能提高心肌细胞 O-GlcNAc 修饰水平 GLP 组，并能模拟 Gln 的作用，增加心 肌细胞核内HSF-1水平及转录活性，增加HSP70的蛋白水平，减少心肌细胞损 伤。因而O-GIcNAc修饰对HSP70表达的影响主要是通过干预其转录因子 HSF-1 的核内水平及转录活性来实现的， 结合 Gln 对 O-GlcNAc 修饰的作用， 我们不难 发现Gln通过提高细胞O-GIcNAc修饰水平来诱导HSP70的表达。我们进一步 推测干预 O-GlcNAc 修饰水

36、平、调控 O-GlcNAc 糖基化的关键酶可能成为休克治 疗的新靶点。 当然，休克需要综合治疗， 综合分析， 对于 O-GlcNAc 修饰与 HSP 表达的机制仍然需要我们进一步评价。结论：LPS刺激心肌细胞给予Gln后，可以通过HBP途径增加UDP-GIcNAc含量, 干预 O-GlcNAc 糖基化的关键酶位点，从而增强心肌细胞 O-GlcNAc 修饰水平， 增加细胞核内HSF-1含量及转录活性，进而促进 HSP70的蛋白表达，并对心肌 细胞产生保护作用。鸣谢：本实验受到江苏省自然科学基金的资助， 工程编号：BK2021303。在此表示感谢！参考文献：1】 Juliann G K, Geor

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