紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究

1、中国食品添加剂分析测试ChinaFoodAdditives紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究欧英杰,曾暖茜,冯志强,许佩勤211(1.广东省食品质量监督检验站,广州󰀁510308;2.广东省食品工业公共实验室,广州󰀁510308)󰀁󰀁摘󰀁要:木瓜蛋白酶具有分解蛋白为氨基酸的能力,是市场上嫩肉粉的主要成分。本文通过测定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小,为判断嫩肉粉质量优劣提供参考依据。把嫩肉粉溶于盐酸半胱氨酸溶液,取该混合液与酪蛋白溶液反应10min,用紫外分光光度法测得反应所生成酪氨酸的含量。该方法

2、具有较好的准确性和重现性,添加标准回收率为96󰀁8%105󰀁8%;且步骤简明,所需测试仪器简单。在该方法条件下,每分钟水解酪蛋白生成1󰀁g酪氨酸所需样品的量为1个酶活力单位。此种酶活力表述方式亦为国内关于各种酶活力的表述所常用,便于酶活力数据的比较与换算。通过测定,发现市售各种嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力参差不齐,则嫩肉粉对肉类的嫩化能力强弱亦有差别,体现在使用添加量的多少和对肉类浸泡时间的长短上。也有发现酶活力为0的,说明该产品中的木瓜蛋白酶已失去活力,或者根本没有添加木瓜蛋白酶,属于伪劣商品。关键词:紫外分光光度法;嫩肉粉;木瓜蛋白酶;酶活力中

3、图分类号:TS207󰀁3󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1006-2513(2010)02-0214-03Determinationofpapain󰀂senzymeactivityinmeattenderizerbyUVspectrophotometryOUYing󰀂jie,ZENGNuan󰀂xi,FENGZhi󰀂qiang,XUPei󰀂qin1211(1.GuangdongFoodQualitySu

4、pervisionandInspectionStation,Guangzhou510308;2.GuangdongProvincialPublicLaboratoryofFoodIndustry,Guangzhou510308)Abstract:Papaincandecomposeproteinintoaminoacidsandistheessentialingredientofmeattenderizer.Thispaperstudiedthedeterminationofpapains'enzymeactivityinmeattenderizer.Theresultscanbeus

5、edforestimatingthequal󰀂ityofmeattenderizer.DissolvemeattenderizerinL-cysteinehydrochloridemonohydratesolution,mixthemeatten󰀂derizersolutionandcaseinsolutionforchemicalreaction10minutesanddetectthecontentofreactionproducttyrosinebyUVSpectrophotometry.Thismethodjustneedssimpleequipment

6、andisconvenient,accurateandpractica.lThetheamountofmeattenderizerfordecomposingcaseinintorecoveryratewas96󰀁8%105󰀁8%.Undertheconditions,usedinhome,1󰀁gtyrosineperminuteisdefinedoneenzymeactivityunit.Thiskindofdefinitionaboutenzymeactivityisusuallysothedataisconvenientforcompare

7、andconversion.Afterdetermination,wefoundtheenzymeactivitydifferentmeattenderrizershaddifferentan󰀂ortheofpapainindifferentmeattenderizerssoldinmarketweredifferent,andthetendercapabilityofmeattenderizerswerealsodifferent.Sohowmuchtouseandhowlongtomarinatethemeat,swers.Wealsofoundsomeenzymeacti

8、vitywaszero,meattenderizerhadnotaddedpapain.Keywords:UVspectrophotometry;meattenderizer;papain;收稿日期:2009-05-08作者简介:欧英杰(1982-),男,本科,研究方向为食品检验。thatindicatedthepapainhadlostitsenzymeactivity,enzymeactivity214󰀁分析测试中国食品添加剂ChinaFoodAdditives木瓜蛋白酶(PapainEC3󰀁4󰀁22󰀁2)属于巯基蛋白酶,可水

9、解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端,并能优先水解在肽链的N端具有2个羧基的氨基酸或芳香L氨基酸(如酪氨酸)的肽键。其最适作用pH为5󰀁07󰀁0,在中性或偏碱性时亦有作用,耐热性强1稀释到500mL,用前配制。三氯乙酸溶液:取三氯乙酸1󰀁8g,加乙酸钠2󰀁99g和冰乙酸1󰀁9mL,加水溶解并稀释至100mL。1󰀁3󰀁对照品和样品的处理对照品溶液的制备:精密称取已在105!干燥至恒重的酪氨酸对照品适量,用0󰀁1mol/L盐酸溶液制成每mL中约含40󰀁g

10、的溶液。供试品溶液的制备:取嫩肉粉约0󰀁5g,精密称定,加酶稀释液搅拌,稀释至100mL。1󰀁4󰀁测定法准确量取供试品溶液各1󰀁0mL,分别置于2支10mL具塞试管中,于(37 0󰀁2)!水浴预热5min,准确加入(37 0󰀁2)!预热的底物溶液5󰀁0mL,立即振摇,置(37 0󰀁2)!水浴中,精确反应10min后,加三氯乙酸溶液5󰀁0mL,振摇,于(37 0󰀁2)!水浴中放置40min,用干燥滤纸过滤,滤液在2h内采用分光光度法以水为

11、空白,在275nm的波长处测定吸收度A;再精确量取供试品溶液1󰀁0mL,置于10mL具塞试管中,于(37 0󰀁2)!水浴预热5min,加入三氯乙酸溶液5mL,振摇,置(37 0󰀁2)!水浴中,反应10min后,准确加入(37 0󰀁2)!预热的底物溶液5󰀁0mL,振摇,于(37 0󰀁2)!水浴中放置40min,用干燥滤纸过滤,滤液在2h内采用分光光度法以水为空白,在275nm的波长处测定吸收度A0。另取酪氨酸对照溶液,以0󰀁1mol/L盐酸溶液为空白,在275nm处测定吸收度An。1&

12、#983041;5󰀁结果计算W3A-A011n1000W10An。目前市场上嫩肉粉的成分主要是木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶通过分解胶原蛋白、弹性蛋白,降解胶原纤维和结缔组织蛋白成为小分子的多肽甚至氨基酸,令肌肉肌丝和腰筋丝断裂,因此嫩肉粉能使老牛肉、猪肚、腊肉等较坚韧肉类迅速嫩化,有利消化并提高营养价值,并可节省烹调时间与能源,适合饭店、宾馆及家庭使用2。酶活力是酶性质的重要参数,显示酶分解底物能力的强弱。木瓜蛋白酶酶活力的测定,采用不同底物衍生的测定方法也不同,所取得的数值也不能进行直接比较。传统的作法,木瓜蛋白酶是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求底物具有较高的专一性和便于

13、标准化,新的测定方法往往采用合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)3。但以BAEE为底物的测定方法所涉4及到的仪器设备昂贵,成本偏高。本文采用以酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力,该法所需测试仪器简单,步骤简明,容易掌握;并且该法也常被国内用来测定各种酶的活力,所得的数据便于比较。对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定,可为嫩肉粉质量优劣提供一项重要的参考指标。1󰀁实验部分1󰀁1󰀁仪器恒温水浴锅;751-GW分光光度计。1󰀁2󰀁试剂酪蛋白溶液:取酪蛋白0󰀁6g,加0󰀁

14、;05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL,置沸水浴中煮30min,时时搅拌,冷至室温,加0󰀁1mol/L盐酸调节pH值至7󰀁0 0󰀁1,用水稀释至100mL,用前配制。酶稀释液:取盐酸半胱氨酸2󰀁635g,氯化钠11󰀁7g,加水250mL溶解,另取乙二胺四乙酸二钠1󰀁115g,加水100mL溶解,合并两液混匀,用4󰀁0mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到5󰀁5,加水酶活力(U/g)=式中:W3#对照品溶液每1mL中含酪氨酸的量,单位为微克(󰀁g);W#供试

15、品的取样量,单位为毫克(mg);10#反应时间;11#测定总体积;n#供试品的稀释倍数;1000#毫克与克的转换倍数。在上述条件下,每分钟水解酪蛋白生成1󰀁g酪氨酸所需的嫩肉粉的量为1个酶活力单位。215󰀁中国食品添加剂分析测试ChinaFoodAdditives2󰀁结果与讨论2󰀁1󰀁标准曲线的绘制用100󰀁g/mL的酪氨酸标准溶液配制标准系列溶液,在275󰀁0nm处进行测定,并绘制标准曲线,见图1,以0󰀁1mol/L盐酸溶液为空白。其回归方程y=0󰀁

16、0075x-0󰀁0019,相关系数r=0󰀁9996。在酪氨酸浓度为0100󰀁g/mL范围内,酪氨酸浓度与吸光度具有良好的线性关系。2󰀁4󰀁样品的检测与分析分别取市售不同嫩肉粉,按上述方法处理,测定其酶活力,结果见表3。表3󰀁样品测试分析结果Tab󰀁3󰀁Resultsofanalysissample样品名称嫩肉粉1嫩肉粉2嫩肉粉3嫩肉粉4酶活力(U/g)51645226965192370015981630平均酶活力(U/g)5195944401614结果表明,市售各种嫩

17、肉粉中木瓜蛋白酶活力参差不齐,则木瓜蛋白酶对肉类的蛋白分解能图1󰀁酪氨酸标准曲线Fig󰀁1󰀁ThestandardcurveofTyrosine力也有较大差异,最终将影响到嫩肉粉的嫩化作用。其中,嫩肉粉2酶活力最高,其每次使用添加量少且肉类浸泡时间短(见该产品的外包装说明);嫩肉粉1酶活力适中,其每次使用添加量比嫩肉粉2略多且肉类浸泡时间也略长(见该产品的外包装说明);嫩肉粉4酶活力较低,其每次使用对肉类需浸泡较长时间(见该产品的外包装说明)。嫩肉粉3酶活力为0,可能该产品里面的木瓜蛋白酶已失去活力,或者该产品根本就没有添加木瓜蛋白酶,属于伪劣商

18、品。可见,嫩肉粉酶活力的大小直接反映了该产品的质量优劣。2󰀁2󰀁精密度取市售嫩肉粉样品1,做6个平行样,由表1可知,酶活力相对标准偏差为2󰀁6%。表1󰀁精密度实验Tab󰀁1󰀁Theresultsoftheprecisiontest测量次数123456酶活力94879366893889729448930592532392󰀁6平均值标准偏差RSD(%)3󰀁结论利用紫外分光光度法能准确地测定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力,该法样品处理简便,所需仪器简单,步骤简明,能快速、直观地测出嫩肉粉中木瓜蛋白酶分解肉类蛋白能力的强弱,为判断嫩肉粉产品质量优劣提供重要参考。参考文献:1张春红.食品酶制剂及应用M.