辅酶四氢叶酸的合成及其活力测定

1、    辅酶四氢叶酸的合成及其活力测定        摘要在利用基因工程菌表达的丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）酶法制备L-丝氨酸的过程中，SHMT需要四氢叶酸作为辅酶。研究了常压氢化法、加压氢化法、硼氢化物还原法及连二亚硫酸钠还原法等制备四氢叶酸，并优化了常压氢化法、硼氢化物还原法的工艺条件。常压氢化法的产品已用来代替进口试剂作为酶促反应的辅酶，但硼氢化物还原法成本最低，且能合成满足酶促反应要求的产物。四氢叶酸在制备过程和使用中，均极易氧化破坏，因此需提供严格的抗氧化条件。关

2、键词叶酸；四氢叶酸；相对活力；硼氢化物；催化氢化 Synthesis of Coenzyme THFA and Determination of Its Relative ActivitySun JinWu WutongChen Zhihong（Biochemical Pharmaceutics College, Chinese Pharmaceutical University, Nanjing, 210009）AbstractSHMT enzymatic preparation of L-ser requires THFA as its coenzyme, the enzyme SHMT

3、is expressed by genetically engineered bacteria. Reduction of FA is the common synthetic method of THFA. These methods include hydrogenation in high-pressure，reduction by hydroborates and reduction by dithionite. This article studied these methods, especially optimized the technology of hydrogenatio

4、n in normal pressure and reduction by hydroborates. The THFA product of hydrogenation in common pressure has been used in enzymatic reaction and expressed the same result as that of THFA from Sigma, the cost of reduction by hydroborates is lower. THFA is oxygenated and destroyed easily during prepar

5、ation and application. Thus, anti-oxidation condition is necessary.Key WordsFolic acid, Tetrahydrofolic acid, Relative activity, Hydroborate, HydrogenationL-丝氨酸（L-serine, L-Ser）是一种含羟基的天然氨基酸，它在医药、化工等领域具有广泛的用途。L-丝氨酸的生产方法有发酵法、化学合成法、丝胶水解法和酶法等。本实验室已建立了含GlyA的重组菌，其表达的丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransfera

6、se, SHMT）可催化甘氨酸（glycine, Gly）与甲醛反应合成L-丝氨酸。在酶促反应过程中，SHMT需四氢叶酸（Tetrahydrofolic acid, THFA）作为辅酶。由于市售四氢叶酸价格昂贵，为降低酶法生产L-Ser的成本，需研究价廉的四氢叶酸合成方法。四氢叶酸主要由叶酸（Folic acid，FA）还原而得，具体的方法有二氢叶酸还原酶法1、常压氢化法26、加压氢化法7，8、硼氢化物还原法912及连二亚硫酸钠还原法6等。其中二氢叶酸还原酶法需ATP及其再生系统，技术和设备复杂，且成本较高，故分别研究了后四种方法。1材料1.1菌种与培养基CSW-7基因工程菌：本实验室构建的含

7、GlyA的重组菌。菌种培养用培养基：LB培养基、玉米浆培养基。1.2试剂叶酸：生化试剂，上海生化试剂分装站；二氧化铂：化学纯，北京化工三厂；硼氢化钠：实验试剂，南京化学工业（集团）公司化学试剂厂；维生素C：生化试剂，江苏江安制药厂；四氢叶酸参照品：Sigma公司；其他试剂均为分析纯或化学纯。1.3仪器与设备常压氢化装置、高压氢化釜：本校药化教研室设备；硼氢化物还原装置：本实验室装配；高效液相分析仪：HP1050，美国。2方法2.1常压催化氢化法在250mL圆底烧瓶中，按50ml/g FA加入冰乙酸和二氧化铂0.2g，接常压氢化装置并检查气密性符合要求后，赶尽空气，在电磁搅拌下通氢活化半小时，然

8、后加入所需量的叶酸，通氢氢化直至吸氢饱和。反应液抽滤后40真空减压浓缩至原体积的一半，将滤液分装于西林瓶中，真空冷冻干燥。2.2加压催化氢化法在500mL高压釜内加入叶酸5g、二氧化铂0.2g、NaOH0.8g和蒸馏水100ml，在57大气压压力下通氢氢化4h，氢化反应混合物用1mol/L HCl调节pH3.03.5,抽滤得湿固体，用冷水洗后真空冷冻干燥。2.3硼氢化钠还原法本法是工业生产甲酰四氢叶酸钙的主要方法，故采用正交设计方法找出最佳工艺条件。影响收率和活力的重要因素有NaBH4量、FA量、反应温度和反应时间，根据预试结果将这4个因素各分为3水平，具体见表1。Tab 1Factors a

9、nd levels of orthogonal experiment design for synthesizing THF through reduction FA by borohydrideLevelNaBH4(g)FA(g)Temperature()Reaction time(h)11.51.510323330234.54.5451根据表1中的因素和水平，选用L9(34)正交表设计确定各次实验的条件，详见表3。于四颈瓶中加入表3中某一实验序号下的叶酸和65ml脱氧水（蒸馏水经煮沸10min后在氮气流中冷却制得），开动搅拌，调节水浴温度使反应液达到所需温度。加入50%NaOH调节pH8.

10、0。密闭四颈瓶，反复抽真空、充氮气3次，赶尽反应系统中的空气。将一定量的NaBH4溶于少量水中，在规定时间内滴加到四颈瓶中。反应结束后用6mol/L HCl调节pH67之间，然后按0.2g/g FA加入Vit.C，继续缓慢滴加盐酸使pH3.03.5。在氮气流中抽滤，得奶油状产物。真空冷冻干燥后得THFA产品。2.4连二亚硫酸钠还原法将Vit.C 4g和Na2S2O4 6g溶于100ml脱氧水并转移至500ml四颈瓶中，用2mol/L NaOH调节pH4.5。叶酸2g溶于15ml 1mol/L NaOH中，将此溶液滴加到四颈瓶中，然后用Vit.C调节pH4.5。在10保温反应5h后用1mol/L

11、 HCl调节pH3.03.2之间。5000r/min离心15min，蒸馏水洗涤沉淀，离心所得沉淀真空冷冻干燥得产品。2.5合成THFA活力和含量的测定2.5.1合成THFA活力测定将3ml LB液体培养基中培养的种子接种至100mL玉米浆培养基中培养19h后，5000r/min离心得湿菌体。酶促反应液中含10mmol/L Gly,500mol/L 5-PLP,0.01%CTAB,13.3mmol/L HCHO, 0.1mmol/L-MET，pH8.0，每5ml的酶促反应液加25mg湿菌，并溶解40mg所合成的THFA。37摇床反应1h后离心，上清用高效液相法测定L-Ser的浓度，计算转化率，将

12、此转化率与利用Sigma的THFA进行酶反应的转化率相比得合成产品的相对活力。2.5.2合成THFA含量测定2精密称取16mg的四氢叶酸以水溶解并定容至100ml，取0.4ml四氢叶酸溶液加到5.6ml含0.1mol/L巯基乙醇的90.5%甲酸中，摇匀后于100水浴中保温5min，使四氢叶酸转化成为5，10-亚甲基四氢叶酸，冷却至室温后在355nm处测定吸光值，由同样操作下所得的标准曲线求得四氢叶酸的含量。 3结果3.1常压催化氢化不同的叶酸、二氧化铂配比合成的四氢叶酸，结果如表2。Tab 2Relative activity in enzymatic reaction and yield o

13、f THFA synthesized by different ratio of FA to PtO2aResults1234567FA(g)0.20.40.60.81.01.21.4Yield(%)9492961001009995Activity(%)b88.986.785.284.387.686.742.3Content(%)90.188.586.285.489.088.745.9a. There were 0.2g PtO2 in each reaction mixtureb. The activity referred to relative catalytic activity 3.

14、2加压氢化还原两次加压氢化的平均重量收率为81%，四氢叶酸的含量为21.3%,酶法测定相对活力仅为20%。3.3硼氢化钠还原硼氢化钠还原的正交实验的结果见表3。从表3中可以看出：以相对活力为优化目标时的最佳工艺条件为NaBH4 4g、FA 3g、反应温度30、反应时间2h，采用此条件进行实验，产品的相对活力为80.7%，较表中各批实验的均高。3.4连二亚硫酸钠还原法采用连二亚硫酸钠法得到的产品重量收率为73%，含量介于56.8%74.1%之间，酶法测定4次实验产品的相对活力介于56%73%。4讨论从表2数据可知：常压催化氢化法中，当FAPtO2=61时，PtO2的用量较少，且产物的相对活力、收

15、率均较高,与文献2中11的配比相比可大幅度减少PtO2的用量。按这一配比所制取的THFA已代替Sigma公司的四氢叶酸用于进行酶促反应，甘氨酸的转化率可达37%40%，与Sigma对照品的转化率相同。Tab 3Result and analysis of orthogonal experiment design for synthesizing THFA through reduction FA by NaBH4No.NaBH4(g)FA(g)Temp()Reactiontime(h)Relativeactivity(%)aYield(%)aContent(%)11.51.510361.837

16、62.821.5330273.73475.131.54.545143.54744.5431.530176.43678.153345374.44676.6634.510272.65774.074.51.545277.33179.784.5310176.55977.294.54.530373.45575.4Mean K1b59.771.870.369.8Mean K2b74.574.974.574.4Mean K3b75.763.265.165.5a. Data of relative activity and yield was the mean value of two separate ex

17、periments.b. Mean K1 was the average value of relative activity at level1. So was Mean K2 or K3. 文献报道12，采用硼氢化物还原法，当温度为45时，合成的四氢叶酸产率最高，而本实验正交实验的结果却是30。这可能是由于反应生成的四氢叶酸在45、pH3时遇光、氧极不稳定，因此，有些研究11采用了较低温度。本文研究了四种合成四氢叶酸的方法，因合成的目的是为SHMT酶促反应生产L-丝氨酸提供辅酶，所以成本和活力是需考察的两个重要方面。四种合成方法中，常压氢化法和硼氢化物还原法所制得的产物相对活力和含量均较其

18、余两法高，故对这两种方法进行了详细研究，结果发现：常压氢化法虽然产品的相对活力最高，但成本较高；而硼氢化物还原法制得的产品虽相对活力稍低，但成本最低，因此该法是合成酶法大规模生产L-Ser所需四氢叶酸的可行方法,同时该研究结果对生产甲酰四氢叶酸钙亦有借鉴作用。从常压催化氢化法所得四氢叶酸的比色测定和活力测定的比较中可知，两法的结果相近。在四氢叶酸的合成和使用中，需严格的防氧化措施，否则反应所生成的四氢叶酸很快被氧化破坏。防止四氢叶酸氧化破坏的方法有：在反应系统中冲氮气以赶走空气；在反应液中加入巯基乙醇、Vit.C等抗氧剂；避光操作；尽可能在较低温度条件下处理等。孙进（中国药科大学生物制药学院，

19、南京210009）吴梧桐（中国药科大学生物制药学院，南京210009）陈志宏（中国药科大学生物制药学院，南京210009）参考文献1，Martinelli JE，Chaykovsky M. A convenient preparation of tetrahydropteridines and tetrahydrofolate analogs. Synth-esis of tetrahydro-3', 5'-dichloromethotrexate. Prep Biochem,1980,10(2)1612，Scrimegeour K G. Methods for reducti

20、on, stabilization, and analyses of folates. Method Enzymol,1980, 665173，Blakley RL. The Interconversion of Serine and Glycine: Preparation and properties of catalytic derivatives of pteroylglutamic acid. Biochem J, 1957,653314，O'Dell B L, Vandenbelt J M, Bloom E S, et al. Hydrogenation of Vitamin Bc(pteroylglutamic acid)and related pteridines. J Am Chem Soc,1947,692505，Huennekens C K, Mathews C K，Scrimgeour KG. Preparation and properties of tetrahydrofolic acid. Method Enzymol,1972,18