RNA干扰作用的机制及应用

1、RNA干扰作用的机制及应用伊正君 朱道银(重庆医科大学微生物学教研室重庆400016摘要 RNA干扰是真核生物界普遍存在的由dsRNA引发的转录后水平的基因沉默。它具有高度的序列特异性、系统性和记忆性,可视为是由dsRNA介导的RNA水平上的序列特异的获得性免疫反应。基于此机制建立的RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。关键词 RNA干扰 基因沉默 获得性免疫RNA干扰作用是一种同源性依赖的转录后水平的基因沉默(pos-t transcriptional gene silencing,PTGS。基因沉默是指生物体中特定序列的外源

2、或内源基因不能表达,目前认为基因沉默是真核生物界普遍具有的一种基因表达调控方式。基因沉默可在两种水平上发生,一种是基于DNA甲基化、位置效应及整合位点的异染色质化等机制引发的转录水平的基因沉默;另一种是发生在基因转录后,通过使靶mRNA特异性降解或阻止其翻译而使目的基因表达受到阻抑的转录后水平的基因沉默。1 RNA干扰作用的机制1.1 同源性依赖的基因沉默(homology-dependent gene silencing,HDGS是指与基因的同源性互作有关的基因沉默,如某些外源基因本身不表达,同时还可导致受体细胞内部相应的同源性基因的表达也受到阻抑。HDGS在TGS、PTGS两种水平上均可发

3、生。在PTGS水平上,双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA作为引发因子或中间体为不同生物基因沉默所共有。1998年Fire等描述了模式生物秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans中由dsRNA介导的PTGS现象并称之为RNA干扰(RNA interference,RNAi。研究表明,植物的抗病毒作用以及共抑制现象(cosuppression、真菌的基因阻抑现象(quelling、动物细胞(如小鼠、人胚肾细胞的RNA干扰现象、某些转座子的转座失活等现象中,存在着共同的PTGS机制,都与双链RNA引发的、同源性依赖的转录后基因沉默有关。为了抵御外来核酸

4、(如病毒侵袭以及转座子等可转移核酸的转座,保护自身性状和基因组的稳定,细胞必须建立有效机制(如通过核酸酶降解、启动基因沉默机制等以清除或抑制这些外来序列。在DNA水平,主要通过DNA 甲基化、异染色质化等机制发挥作用;在RNA水平,则主要通过RNA干扰作用来实现。因此认为RNA干扰是真核生物界普遍存在的一种对抗外源基因表达的免疫机制,本质上是由dsRNA介导的RNA水平上的序列特异的获得性免疫反应1。关于RNA介导产生PTGS的具体机制,目前有RNA阈值模式、分子间碱基配对模式、异常RNA模式等多种假说。各种模式统一于最终产生了双链RNA 或发夹状RNA(hairpin RNA,hpRNA,它

5、们由病毒、转座子、重组基因等直接转录产生,或由其转录产生的异常RNA(Aberrant RNA,aRNA激活RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP后产生,还可以是某些病毒复制时形成的双链RNA中间体。没有双链RNA的正常细胞正是利用这些中间体来识别和抵御外来核酸入侵的;RNAi发生的后继过程是,出现在细胞中的外源或内源的dsRNA首先在类Rnase 型核酸酶(如Dicer作用下切割成小片段干扰RNA(smal-l interfering RNA,siRNA,这些siRNA与Dicer等蛋白质结合生成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induc

6、ed silencing complex,RISC,其中的siRNA具有同源性依赖的引导功能,在siRNA的引导下,RISC被引导到有同源序列的靶mRNA并与之特异结合,随后mRNA被切割降解。在此过程中,内源基因的同源转录产物也可被结合和降解,结果外源基因的导入使内源和外源基因的表达共同受阻。RNAi效应具有自我扩增性,少量dsRNA即可发挥阻抑效应,能够在细胞间传递,甚至将此效应传至下一代。Brenda等认为在RNAi过程中包括RdRP介导的dsRNA扩增反应,从而使PTGS具有持久性和系统性。1.2 支持以上结论的证据是,Hunter通过纯化将RNA 合成过程中形成的dsRNA去除后,只

7、把正义或反义的单链RNA注入线虫卵中没有产生预期的RNAi表型,但如果将这些单链RNA混合退火复性后得到dsRNA 再注入线虫卵中则可以产生显著的RNA干扰现象,这表明RNAi是由于dsRNA的存在而引起的;Hamil ton等在发生PTGS的植物中分离到了一种25个核苷酸左右的与被沉默基因同源的RNA片段,未发生PTGS的植物中则不能检出,推测即是由RdRP聚合产生的cRNA 片段;利用遗传学方法,在不同物种中筛选鉴定出多种RNAi所必需的基因,同源性比较表明,它们所编码的蛋白质与植物中的RdRP具有高度的同源性,RdRP是RNAi作用中的关键酶之一,它参与催化dsRNA的生成112003年

8、第38卷第5期 生 物 学 通 报和大量扩增;Berns tein等2则从果蝇中成功地分离出能特异性切割dsRNA的进化保守的RNase 家族核酸酶 Dicer ,并通过实验证实了它具备RNA干扰核酸酶所定义的全部功能,即双链RNA的结合、解螺旋和对RNA的切割降解作用,从另一角度提供了直接证据。2 RNA i基因阻抑技术RNA干扰技术系指,利用外源导入或转录载体体内转录的双链RNA介导受体细胞中序列特异的同源性靶mRNA发生降解或翻译受阻,引发受体细胞产生PTGS,使与此相应的内源靶基因表达被阻抑,从而得到类似于 基因敲除 的基因阻抑效果。它包括用于干扰的iRNA(interfering R

9、NA片段的设计与合成、iRNA的标记、iRNA的转染、RNA干扰效果的检测等步骤。RNAi作用是归结于dsRNA的存在而引发的,所以RNAi技术中的RNA一般是设计成双链的;dsRNA的长度也是影响干扰效应的重要参数,对非哺乳动物细胞而言,较长的dsRNA(>100bp阻抑效果较强。在哺乳动物细胞中,较长(>30bp的d sRNA由于诱发了细胞内的干扰素系统和激活了RNA依赖的蛋白激酶(PKR,产生的抑制作用是广泛的、非特异性的,小干扰RNA(2123bp才可以在此类细胞中诱导出可重复的、序列特异的RNA干扰作用3,因此应根据研究对象的不同设计双链RNA的长度;RNAi是在转录后水

10、平上运作的,只含内含子序列的dsRNA理论上无法引发RNA干扰,同时所设计的dsRNA必须要与靶基因有较高的同源性以保证对其他无关序列的表达和同基因家族的成员无干扰作用;同一靶mRNA选不同的位点设计产生的RNA干扰效果亦有较大差异4;可见dsRNA 的设计与合成是RNAi技术中关键性的一步。dsRNA的合成包括化学合成法、体外转录法、转录载体体内转录法等。用于RNAi技术的RNA可以是dsRNA,也可以是单链茎环结构的短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNAs。Kennerdell等发现如果将发夹结构的RNA引入受体细胞则可以产生稳定遗传,或者将反式重复的外源基因转入

11、受体细胞中使其形成具有发夹结构的转录产物也能实现基因沉默的稳定遗传。转录载体体内转录法是利用DNA质粒为载体,导入受体细胞中,经细胞内转录后生成siRNA,优点是可以和其他带选择性标记的质粒共转染,无须另外合成寡核苷酸片段,且可保证持久和稳定地表达siRNA,从而打破了传统方法必须提前合成siRNA和短暂性两个限制,使RNAi技术真正成为了可被广泛采用的有力工具5。dsRNA的标记一般采用荧光标记法,可对RNAi作用的过程及结果进行示踪和观察。针对不同的研究目的和对象,dsRNA的转染可采用显微注射法、脂质体介导法、电穿孔法、浸泡法、饲喂法等。RNA干扰作用的检测可根据不同的实验目的,从整体水

12、平(生物表型分析、细胞水平(免疫荧光法定位和示踪、表达水平( Western和转录水平(Northern全方位、多层次进行检测。3 研究R NA干扰机制及其技术的理论和实践意义3.1 功能基因组学研究:利用RNAi技术可以做逆向基因分析,即在已知某生物基因序列后,有目的性地运用RNAi技术针对一段特定的基因进行干扰,使之不能表达,继而出现功能或个体表型的改变。则这段基因序列在该生物基因组中的功能即可明确。RNAi现象的普遍性使之成为强有力的反向遗传学研究工具,利用该技术可以产生大量的缺陷型个体并可对大量的表型模拟的突变体进行生化分析,可用于遗传育种、胚胎发育研究6等。3.2 应用于微生物学研究

13、:随着后基因组时代的来临,明确各基因的功能及其调控机理已经成为研究前沿。在对基因组庞大、组成复杂的微生物进行分析时, RNAi技术开辟了一种新奇而高效的捷径,由于它的高度序列特异性,使同时对多个基因进行功能分析并探求它们之间的相互作用关系和协同效果成为可能。深入研究RNA干扰的作用机理使人们对微生物感染与免疫的认识打破了蛋白质水平的局限,建立了核酸免疫的概念,目前发现某些病毒的抗性不是由蛋白质而是由RNA介导的,这种抗性称为RNA介导的病毒抗性。Dvaid等认为在动物中RNAi代表一种古老的抗病毒反应,与植物的PTGS一样是抵抗病毒感染的有效办法。Sharp发现在哺乳动物细胞中dsRNA能够通

14、过以上机制引发对病毒的抗性,产生抗病毒效应。在哺乳动物细胞中,长片段的RNA只需少量即可引起非特异性的干扰素反应并导致细胞凋亡,而短片段的siRNA则可以引发序列特异性的RNA干扰作用。由此可以认为dsRNA使核酸水平上的非特异性免疫和特异性免疫统一了起来。于此相反,Marx发现有些病毒在进化过程中已经获得了抑制宿主沉默的基因,Voinnet等已在植物病毒中发现了多种RNA沉默抑制蛋白并证明它们是病毒的致病因子。通过RNAi技术研究这些对抗机制以及对抗过程中启动的信号转导通路、相关基因开闭的调控方式等,有望发现预防和治疗微生物感染,尤其是某些病毒感染的新方法。Coburn等7利用siRNA产生

15、RNA干扰作用抑制HIV-1的Tat和Rev蛋白的表达,有效抑制了HIV病毒在培养的人T细胞中的基因表达和复制。12生 物 学 通 报 2003年第38卷第5期中国青少年生长变化存在问题和干预措施季成叶(北京大学儿童青少年卫生研究所北京100083伴随社会经济发展和生活水平提高,我国青少年正经历深刻的生长长期变化(secular growth shift。因起步晚,目前总体生长水平较低,但增长潜力很大。本文通过描绘中国青少年近15年来的生长变化,提出改善策略和措施,以提高我国跨世纪一代人的生活质量。所用资料来自1985年、1995年和2000年全国学生体质调研,均有数十万人参加,随机抽样自全国

16、所有省区市,在反映中国青少年生长发育时最具代表性1。通常分城乡、男女4组分析生长发育现状,但因城乡不同群体间因社会经济不同而导致的差异很大,所以在部分分析中,将全国青少年按分层原则,归纳成4个群体: 大城市 ,(占总数17%, 中小城市 (占13%, 富裕农村 (占20%, 中下水平乡村 ,(占50%2。1 中国青少年19852000年期间体格迅猛增长1.1 身高近15年来增长迅速。以718岁平均增幅计,城市男孩、城市女孩、乡村男孩、乡村女孩分别增长4.2cm、3.1cm、4.8cm和3.7cm。乡村青少年生长基数低,身高增幅超过城市。如将19852000年分两阶段,可发现前10年的身高增幅较

17、快,城市男孩、城市女孩、乡村男孩、乡村女孩分别增长3cm、2.2cm、3.5cm和2.8cm,主要表现为青春期突增提前。以突增高峰年龄为例,13岁城市男孩从153.7cm增长到158.7cm,增幅5cm;乡村男孩从148.4cm增长到153.8cm,增幅5.4cm。12岁城市女孩从147.6cm增长到151.7cm,乡村女孩从142.5cm增长到147.5cm,增幅分别为4.1和5cm。当今的13岁男生和12岁女生,身高分别相当于15年前的13.7岁男生和12.6岁女生。后5年中城市男孩、城市女孩、乡村男孩、乡村女孩平均身高分别增长2.5cm、1.9cm、2.5cm和1.9cm。也主要表现为青

18、春期提前,但增幅较前10年略低。这5年的突出表现是,1618岁(青春后期阶段增幅显著超过前10年。城市男孩、城市女孩增幅超过前10年一倍;乡村男孩、乡村女孩增幅略小,但也分别超过前10年50%和30%。这和1995年以来国民经济增长迅速、人民在生活和营养上取得更大的实惠有关。前10年的青春期提前趋势是发达国家生长长期趋势的早期共有的,伴随城市化、工业化趋势自然发生;后5年的身高增长具有更强有力的物质基础(如优良蛋白质摄入增加,将促进成年身高显著提高,充分展现中国人的生长潜力,因而更具实质意义。15年来体重的增幅比身高更惊人,也有青春期提前的明显表现。城市男孩、城市女孩、乡村男孩、乡村女孩7岁体

19、重分别从1985年的21.5kg、20.6kg、20.3kg 和19.6kg增长到达2000年的24.6kg、23.1kg、22.2kg 和21.3kg。该4群体13岁体重分别从1985年的40.2 kg、41.2kg、37.4kg和39.5kg增长到2000年的47.8 kg、45.1kg、42.3kg和41.8kg;18岁体重分别从1985年的56.4kg、49.6k g、55.8kg和50.5kg增长到2000年的61.6kg、51.8kg、58.1kg和51.0k g。3.3 用于基因治疗、信号转导8、基因表达调控机理的研究等领域:RNAi作用具有高特异性、高效性,因此可以用于基因治疗

20、;利用该技术可以实现在特定时期针对特定组织细胞对目的基因进行阻抑,使精确研究信号转导、基因表达的调控机理成为可能,如用于分析细胞的生长、分化、凋亡过程中各个时期的基因表达及其调控等。总之,随着RNAi机制研究的深入和RNA干扰技术的日趋完善,它作为一种便捷实用的基因研究工具,在众多领域将具有广阔的应用前景。参考文献1 邵先安,熊思东.基因沉默:获得性免疫的新途径.生命的化学,2001,21(6:462 464.2 Berns tei n E,Caudy A A,Hammond S M et al.Role for a biden-tate ri bonuclease in the ini tiation step of RNA i nterference.Na-ture,2001,409(6818:363 366.3 Oshiumi H,Be gum NA,Matsumoto M e t al.RN A interferencefor mammalian cells.Nippon Yakurigaku Zass hi,2002,120(2:91 95.4 Holen T,A marzguioui M,Wii ger MT et a