分光光度法α-半乳糖苷酶活力测定

1、分光光度法-半乳糖苷酶活力测定A.1 -半乳糖苷酶活力测定A.1.1 定义：在pH5.5并37条件下，每分钟内从10mmol/L对硝基酚-D-吡喃半乳糖中降解释放1mol对硝基酚所需要的酶量为一个酶活单位U。A.1.2 原理：-半乳糖苷酶能将对硝基酚-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。通过400nm比色测定释放的对硝基酚的量，可以计算反应液中-半乳糖苷酶的活力。A.1.3 试剂、溶液A.1.3.1 醋酸钠缓冲液，浓度c（CH3COONa）为0.05 mol/L，pH值为5.5：A液：称取无水醋酸钠4.2g定容至1000mL；B液：冰醋酸3.0 mL定容至1000 mL。用B液调节A液至pH5.5。

2、A.1.3.2 碳酸钠溶液，浓度c（NaCO3）为0.2mol/L：准确称取21.198g无水碳酸钠，定容至1000mL。A.1.3.3 对硝基酚标准溶液，浓度c 为10 mmol/ L：称取0. 1391 g 对硝基苯酚，精确到0. 001 g ,用碳酸钠溶液定容至100 mL，低温保存。依次移取对硝基苯酚标准贮备液1 mL 、2 mL 、3 mL 、4 mL 、5 mL 、7 mL 、9 mL ,用碳酸钠溶液定容至100 mL ,配成浓度为0.1 mmol/ L 、0.2 mmol/ L 、0.3mmol/ L 、0.4mmol/ L 、0.5mmol/ L 、0.7mmol/ L 、0.

3、9mmol/ L 的对硝基苯酚标准工作液。A.1.3.4 对硝基酚-D-吡喃半乳糖溶液，浓度c 为10mmol/L：称取3.031g对硝基酚-D-吡喃半乳糖，用醋酸钠缓冲液定容至1000mL，置棕色试剂瓶于4 以下保存。 A.1.4 仪器、设备 A.1.4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。A.1.4.2 分样筛：孔径为0.25 mm（60目）。A.1.4.3 分析天平：感量0.001 g。A.1.4.4 pH计：精确至0.01。A.1.4.5 磁力搅拌器：附加热功能。A.1.4.6 电磁振荡器。A.1.4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45 mm。A.1.4.8 离心机：2000 r/min。A

4、.1.4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060之间，精度为0.1。A.1.4.10 秒表：每小时误差不超过5s。A.1.4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。A.1.5 分析步骤A.1.5.1 标准曲线的制作吸取1mL对对硝基酚标准溶液（A.1.3.3）于试管中，加入1mL醋酸钠缓冲液(A.1.3.1)；对照的空白试管中加入2mL醋酸钠缓冲液（A.1.3.1)；在所有的试管中加入8mL碳酸钠溶液(A.1.3.2)，振荡，在400nm处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。A.1.5.2 试样溶液的处理固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60

5、目筛（孔径为0.25 mm），称取固体样品1g左右，用80mL醋酸钠缓冲液(A.1.3.1)浸泡，磁力搅拌30分钟，用醋酸钠缓冲液(A.1.3.1)定容至100mL，用Whatman No.1滤纸过滤。液体试样可以直接用醋酸钠缓冲液(A.1.3.1)进行稀释和定容。当酶液的酶活在20U/L以内，测试结果较准确。A.1.5.3 测定步骤将上述稀释酶液（A.1.5.2）和底物对硝基酚-D-吡喃半乳糖溶液（A.1.3.4）于37下振荡10分钟预热。然后再吸取各溶液0.1mL，充分混合，于37恒温振荡10分钟，加入0.8mL碳酸钠溶液(A.1.3.2)，振荡混匀，终止酶反应，以蒸馏水调零，在400nm处测定吸光度OD值。酶液空白用经过预热的酶液各0.1mL，然后加入0.8mL碳酸钠溶液(A.1.3.2)，振荡混匀，再各加入0.1mL预热的底物对硝基酚-D-吡喃半乳糖溶液（A.1.3.4）于37振荡10分钟，在400nm处测定吸光度OD值。A.1.6 计算M × t(Ax-Ao×K+Co)×DfX =式中：Ax样品酶液的吸光度OD值；Ao对应酶液的空白吸光度OD值；K对硝基酚的标准曲线的斜率；Co对硝基酚的标准曲的截距；Df稀释倍数；M称取酶制剂的质量