探讨赤雹果多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

1、探讨赤雹果多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响摘要：目的观察赤雹果多糖对免疫抑制模型小鼠免疫功能的影响。方法采用环磷酰胺（CY）造模法制作小鼠免疫抑制模型，观察赤雹果多糖对实验动物免疫 器官重量指数、碳粒廓清能力、迟发型变态反应（DTH）、溶血素（IgM）含量的影响。 结果赤雹果多糖400, 200 mg- kg-1剂量组能显著提高小鼠免疫脏器指数、单核 巨噬细胞的吞噬功能及小鼠迟发型超敏反应，促进溶血素的生成。结论赤雹果多 糖有显著提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用。关键词：赤雹果；多糖；免疫功能；环磷酰胺赤雹果为葫芦科，多年蔓生草本植物赤雹 Thladia ntha dubia Bunge的干燥成

2、熟果实，广泛分布于华北、东北等地，具有理气、降逆、祛痰、止血等作用， 民间用赤雹果水煎剂治疗腰腿痛、风湿痛、痛经、软组织扭伤等，疗效显著。前 期研究显示赤雹果中富含多糖类成分，其水提物和醇提物具有显著的抗炎镇痛及 抗过敏作用，且无明显的毒副作用2，3。多糖是多种中草药的有效成分，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多方面的 药理活性，赤雹果多糖的免疫增强功能可能是赤雹果抗炎机制的组成部分。本文考察了赤雹果多糖对免疫抑制模型小鼠免疫功能的影响，为赤雹果抗炎作用机制的研究及赤雹果的深入开发提供理论依据。1材料与仪器动物昆明种小鼠，雌雄各半，体质量 1822 g，由河北医科大学实验动 物中心提供，合格证号：

3、903014。试药与仪器赤雹果，采自河北省青龙满族自治县 （20XX-10采集，由承德 医学院中药研究所赵春颖副研究员鉴定为葫芦科植物Thladia ntha dubia Bunge的成熟果实，样本保存于承德医学院中药研究所）。三氯乙酸（天津大茂化学试剂 厂）;环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：08120521）;印度墨汁（CHROMA GMBH&CO绵羊红细胞（承德医学院动物中心提供）;HP-8453紫外可见分光光度 计（美国惠普公司）;AG-245型电子分析天平（瑞士 Mettler公司）。2方法与结果赤雹果多糖的提取称取赤雹粗粉适量，置圆底烧瓶中，加入适量石油醚（6090

4、C）回流提取1 h，滤过，滤渣挥干溶媒，以80聽醇回流提取2次，1 h/ 次，滤过;滤渣置圆底烧瓶中，加入蒸馏水浸泡数小时后回流提取 2次，1 h/次， 滤过，两滤液合并；合并液浓缩至小体积，加入体积比为 1 ：1的5%三氯乙酸溶 液，静置2 h后离心、过滤，滤液用95聽醇调含醇量80%放冰箱内(4 C)静 置过夜，次日抽滤，滤渣以无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤数次，得白色粉末样 物质，60 C烘干，即得赤雹果多糖。实验动物分组与给药取小鼠200只，每个实验50只，随机分为5组，即 正常对照组、模型组、赤雹果多糖高剂量组(400 mg- kg-1 d -1) 中剂量组(200 mg- kg-1

5、d -1)和低剂量组(100 mg kg-1 d -1，每组10只。各实验组均每天 灌胃给药1次，正常对照组和模型组用等体积的 生理盐水灌胃，连续16 d,于 第15，16天灌胃给药的同时腹腔注射 沥磷酰胺，剂量为50 mg- kg-1，正常对 照组腹腔注射等体积的生理盐水。小鼠免疫器官重量的测定第2次腹腔注射 灿磷酰胺24 h后，称小鼠体质 量，颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏、胸腺称其湿重，计算脾指数和胸腺指数。脾指 数= 脾重量(mg)/体质量(g);胸腺指数二胸腺重量(mg)/体质量(g)。结果见表1表 1赤雹果多糖对CY致免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响单核巨噬细胞吞噬功能(碳粒廓清速率)的测

6、定第17天再给药1次，给药 后1 h，称体质量，各鼠均按-10g-1剂量由尾静脉注入印度墨汁(以生理盐水按 1 ：5稀释)，注射后分别在2 min(、20 min(t2)从小鼠眼眶静脉丛取血20卩l， 溶于ml的%Na2CO溶液中摇匀，放置20 min后于650 nm处测其吸光度值(A)， 以%Na2CO溶液做空白对照，将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸吸干血迹后称 重，根据公式计算廓清指数 K值和校正廓清指数a值。结果见表2计算公式： K=(logA1-logA2)/(t2-t1);a =K1/3X体质量 /(肝重 + 脾重)小鼠血清溶血素的检测第2次腹腔注射 哪磷酰胺24 h后，摘眼取血，放

7、 置1 h，离心，分离血清。血清用生理盐水稀释 250倍，从中取1 ml加至反应 管中，再加入ml的10%SRBC加入补体1 ml(以生理盐水1 : 10稀释过的豚鼠 血清作为补体)，移至37 C恒温水浴锅中，保温30 min，取出后置冰浴中以终 止反应，用2 000 r - min-1离心10 min，取上清液1 ml，加入3 ml都氏试剂 混匀，10 min后在540 nm处进行比色，记录各样品的吸收值(OD)。另设10%ml， 加4 ml都氏试剂，同法测出SRBC半数溶血吸收值，按照下列公式计算每个样品 的半数溶血值(HC50 )。结果见表2表2赤雹果多糖对CY致免疫抑制小鼠碳粒 廓清及

8、血清溶血素的影响对迟发型变态反应(DTH)的影响第15，16天小鼠腹腔注射磷酰胺后， 每鼠腹腔注射2% SRBC ml致敏，致敏后第4天，于小鼠右侧足垫皮下注射 20%SRB悬液50卩l,左侧注射50卩l生理盐水，分别于3, 24 h后用游标卡 尺测定小鼠左右足趾厚度之差为肿胀程度。同一部位测量3次，取平均值。结果见表3表3赤雹果多糖对CY致免疫抑制 小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响由表3可知，与模型组相比，赤雹果多糖 400, 200 mg- kg-1 d-l剂量组 能显著增强SRBC攻击后3, 24 h小鼠出现的肿胀反应，使 CY抑制的反应趋于恢 复正常，说明赤雹果多糖可增强 CY所致免

9、疫抑制模型小鼠的体液免疫和细胞免 疫反应能力。3讨论大量的药理和临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活 免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞没有明显毒副作用。 临床所见的 多种疾病多伴有免疫功能低下，本实验采用了免疫抑制小鼠模型观察赤雹果多糖 的免疫调节作用，更加接近于临床应用。环磷酰胺(CY)是一种作用较强的免疫抑制剂，常用于制备免疫低下模型。 本实验中，正常对照组和 CY模型组实验指标差异具有统计学意义，说明成功制 造出了免疫抑制小鼠模型。脾脏和胸腺是人体重要的免疫器官，两者相对重量的变化在免疫评价中占 有重要的地位。赤雹果多糖组的脾脏和胸腺指数显著高于模型组，表明其能

10、改善 CY引起的脾脏和胸腺萎缩，对免疫器官有一定的免疫促进作用。单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一。印度 墨汁通过静脉注入小鼠血循环后，迅速被单核巨噬细胞所清除，主要被定居在肝脏和脾脏的巨噬细胞所吞噬，若印度墨汁量恒定，则从血流中清除的速率可 反映单核巨噬细胞的吞噬功能。赤雹果多糖能够明显激活、增强CY所致免疫抑制小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能，表明其对 CY所致免疫抑制模型小鼠的非特异 性免疫功能有增强作用。溶血素测定法是影响特异性免疫功能的实验方法之一。由于致敏小鼠血清 中的抗体一一溶血素(IgM)，与绵羊红细胞一起体外温育，在补体参与下，可产 生溶血反应，而血清中溶血

11、素的含量可通过溶血过程中释放的血红蛋白来检测， 用分光光度计比色测定。赤雹果多糖能明显增加CY所致免疫抑制模型小鼠血清溶血素含量，拮抗CY所致的体液免疫抑制，说明赤雹果多糖能够提高其体液免 疫能力。在SRBC诱导的DTH模型中，一般认为SRBC攻击后3 h正常小鼠出现的肿 胀反应是由特异性抗体介导的反应，攻击后 24h出现的肿胀反应则是T细胞介 导的反应，它们分别反应了体液免疫和细胞免疫反应的状况。赤雹果多糖高、中 剂量组能显著增强SRBC攻击后3, 24 h小鼠出现的肿胀反应，表明其具有增强 小鼠体液免疫和细胞免疫反应的能力。赤雹果中富含多糖类成分，植物赤雹药源丰富、易于种植，具有巨大的研究

12、价值与应用前景。【参考文献】宋立人,洪 恂,丁绪亮,等.现代中药学大学辞典,上册M.北京：人民卫 生出版社,20XX:1022.刘建东.赤雹果乙醇提取物的抗炎作用的实验研究J.中国医药指南,20XX, 7(2) :40.佟继铭,李兰芳,宋利萍,等.满药赤雹果水溶性提取物镇痛作用的研究J. 承德医学院学报,20XX,23:338.余薇,汪 晖,吴基良中药多糖的研究进展J.咸宁学院学报,20XX,21(6):548.沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术M.武汉:湖北科学技术出版社,20XX:6.徐叔云.药理实验方法学M.北京：人民卫生出版社，1991:1233.李义奎,王钦茂.中药药理实验方法学M.上海:上海科学技术出版社,1989 : 159.谭