流式细胞仪分析技术及应用ppt课件

1、 流式细胞仪 分析技术及运用 FCM FCM是以流式细胞仪为检测是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、准确的对手段的一项能快速、准确的对单个细胞理化特性进展多参数单个细胞理化特性进展多参数定量分析和分选的新技术。定量分析和分选的新技术。什么是流式细胞术什么是流式细胞术(FCM)(FCM)？第一节第一节 流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析第三节第三节 流式细胞仪分析的技术要求流式细胞仪分析的技术要求第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中运用流式细胞术在免疫学检查中运用 一一 任务原理：任务原理： FCMFCM是一种在计算机技术支持下

2、的高度是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。第一节第一节 流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理 1 1、液流系统、液流系统 样品流和鞘流样品流和鞘流 2 2、光学系统、光学系统 激光、透镜组、激光、透镜组、 光电倍增管等。光电倍增管等。 3 3、数据处置系统、数据处置系统( (一一 根本组成构根本组成构Injector TipSheath fluid样品流和鞘流样品流和鞘流1 1、液流系统、液流系统PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow ce

3、ll 激光、透镜组、光电倍增等。激光、透镜组、光电倍增等。2 2、光学系统、光学系统 二二 根本任务原理根本任务原理单细胞流：流动室单细胞流：流动室单细胞照明：激光单细胞照明：激光488 nm laser488 nm laser单细胞检测：信号处置单细胞检测：信号处置一前向散射光一前向散射光 (foword scatter)(foword scatter)：FSCFSC 信号的强弱与细胞的大小相关信号的强弱与细胞的大小相关二侧向散射光二侧向散射光side scatter)side scatter)：SSCSSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关二二 散射光的测定

4、散射光的测定FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter细胞对光的散色景象与细胞样品制备无关细胞对光的散色景象与细胞样品制备无关. .90 Degree Light ScatterFALS Sensor90LS SensorLaser细胞对光的散色景象与细胞样品制备无关细胞对光的散色景象与细胞样品制备无关. .前向散色光前向散色光FSCFSC侧向散色光侧向散色光SSCSSC 利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。散射光的测定散射光的测定 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长一

5、光信号丈量一光信号丈量 线性放大器线性放大器 对数放大器对数放大器三三 荧光丈量荧光丈量600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser LinesExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm二荧光补偿二荧光补偿 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿一分选的根本原理一分选的根本原理488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS Sens

6、orFluorescence detector四四 细胞分选原理细胞分选原理阳性选择阳性选择MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分别磁珠分别阴性选择阴性选择1 1 、分选速度：几千个细胞、分选速度：几千个细胞/ /秒秒2 2 、分选纯度、分选纯度:99.5%:99.5%左右左右3 3 、分选收获率、分选收获率:90-95%:90-95%4 4 、分选得率、分选得率二分选的技术要求二分选的技术要求 分选纯度 是指分别后的样品中该亚群细胞所占的百分比。 分选收获率 是指分别后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分

7、比。第二节第二节 数据的显示和分析数据的显示和分析 一、参数前向散射光FS: 反映颗粒的大小侧向散射光SS: 细胞内部构造复杂程度荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少二、数据的显示方式二、数据的显示方式一一 单参数直方图单参数直方图二二 双参数显示双参数显示三三 三参数显示三参数显示 以分布直方图( distribution histogram )来显示，横轴为该参数丈量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴普通是细胞数或细胞出现的频数。( (一一) ) 单参数直方图的显示单参数直方图的显示Single-Parameter Histogram DisplaysX

8、轴表示绿荧光信号轴表示绿荧光信号(CD3)强弱强弱,Y轴那么反响细胞的数轴那么反响细胞的数量量.( (二二) )双参数数据的显示双参数数据的显示Two-Parameter Data DisplaysTwo-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个丈量参数，纵轴代表第二个丈量参数。 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个丈量纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个丈量参数参数, ,在图中每一个

9、点代表一个细胞在图中每一个点代表一个细胞1 1 、点图、点图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。同，不同的等高线上细胞数不同。2 、二维等高图、二维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个丈量参纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个丈量参数数,Z,Z轴为细胞数。轴为细胞数。3 、假三维等高图、假三维等高图 三维坐标匀为参数散射光或荧光而三维坐标匀为参数散射光或荧光而非细胞数。非细胞数。( (三三) ) 三参数直方图三参数直方图 普通利用所得参数的两两组合并利用设门普通利用所得参数的两两组合并利用设门Gate)技术，来

10、分析参数之间的相互关系。技术，来分析参数之间的相互关系。四流式细胞仪的多参数分析四流式细胞仪的多参数分析1 、Region设置设置2 、 设置设置Gate 样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的反复性 质量控制第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 细胞碎片细胞碎片 细胞团块细胞团块 离心漂洗离心漂洗 固定剂固定剂一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备 淋巴细胞分别液分别外周血中单个核细胞。淋巴细胞分别液分别外周血中单个核细胞。Ficoll,40kdFicoll,40kd，高密度，低浸透压，无毒性。，高密度，低浸透压，无

11、毒性。比重为比重为1.01771.01770.0010.001的分层液的分层液).).一外周血淋巴细胞样品的制备一外周血淋巴细胞样品的制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中一切白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图 单层培育细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法单层培育细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培育皿上消化下来，然后离心漂洗。使细胞从培育皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培育细胞，可不用酶消化，直接吹打制备悬浮培育细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。成单细胞悬液。二二) ) 培育细胞的样品制备培育细胞的样品制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。机械法：剪碎法、网搓法、

12、研磨法。 酶处置法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶处置法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。酶等。 化学试剂处置法：化学试剂处置法：EDTA、EGTA等。等。 外表活性剂处置法：外表活性剂处置法： Triton-100、皂素、皂素等。等。(三三)新颖实体组织单细胞悬液的制备新颖实体组织单细胞悬液的制备 机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处置的方法排除团块和碎片的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会呵斥所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散形状；对细胞团块，细胞碎片尽能够少；细胞的活性不受损害，

13、以保证下一步的荧光染色处置不受影响。 防止细胞自溶，坚持细胞膜原有的特性保管的方法：防止细胞自溶，坚持细胞膜原有的特性保管的方法：1 1、深低温保管法：深低温冰箱，保管一年。、深低温保管法：深低温冰箱，保管一年。2 2、乙醇与甲醇保管法：、乙醇与甲醇保管法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞外表荧光染色分析不受影响。细胞外表荧光染色分析不受影响。( (四单细胞悬液的保管四单细胞悬液的保管 染料的选择和标志染色保证了荧光信号的产生一免疫荧光标志最常用的荧光染料荧光染料荧光

14、染料 激发波长激发波长nm) 发射波长发射波长nm) 颜色颜色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色二、免疫分析中常用的荧光染料与标志染色二、免疫分析中常用的荧光染料与标志染色 用化学法将两

15、种不同激发波长的染料结合在一同，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY5PECY5CY5488nm能量传送染料：能量传送染料：荧光染料与细胞成分的结合方式：荧光染料与细胞成分的结合方式： 构造亲和方式构造亲和方式 嵌入结合方式嵌入结合方式 共价结合方式共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式荧光抗体特异性结合方式1、直接免疫荧光染色、直接免疫荧光染色2、间接免疫荧光染色、间接免疫荧光染色二免疫荧光标志二免疫荧光标志3、双或多参数荧光抗体的组合标志、双或多参数荧光抗体的组合标志FITC+PE 488 525 、575 绿色、橙色绿色、橙色FITC+T

16、 red 488 525 绿色绿色 568 615 红色红色FITC+PeCy5 488 525、 675 绿色、绿色、 红色红色FITC+ ECD 488 525、 625 绿色、橙红色绿色、橙红色F+P +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、红色绿、橙、红色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 绿、绿、 橙红色、红色橙红色、红色F+P+APC 488 525 、 575 绿色、橙色绿色、橙色 633 670 红色红色荧光染料荧光染料 激发波长激发波长nm) 发射波长发射波长nm) 颜色颜色 FITC FITC的激发的激发波优点于自发波优点于自发荧光的光

17、谱区荧光的光谱区内，因此内，因此FITCFITC荧光易受自发荧光易受自发荧光的干扰。荧光的干扰。( (三三) ) 细胞的自发荧光细胞的自发荧光一单细胞悬液制备的质量控制一单细胞悬液制备的质量控制二细胞悬液免疫荧光染色的质量控制二细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响、固定剂对荧光染色的影响三仪器操作技术的质量控制三仪器操作技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制 1 1、同型对照：选用一样源性的未

18、标志单抗作为、同型对照：选用一样源性的未标志单抗作为同型对照阴性对照同型对照阴性对照 2 2、全程质控：在流式检测中，样品标志、溶血、全程质控：在流式检测中，样品标志、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用规范质控样品来进展全程质控，响检测结果。采用规范质控样品来进展全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。四免疫检测的质量控制四免疫检测的质量控制一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 淋巴细胞是机体免疫系淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群，统中的一群

19、重要细胞群，是参与免疫调理和执行细是参与免疫调理和执行细胞免疫功能的免疫活性细胞免疫功能的免疫活性细胞，胞，T细胞、细胞、B细胞和细胞和NK细胞，各自发扬不同的作细胞，各自发扬不同的作用。用。第四节第四节 流式细胞在免疫学检查中的运用流式细胞在免疫学检查中的运用三色标志三色标志 淋巴细胞淋巴细胞T、B、 NK1、Th 细胞：细胞：CD3+ CD4 + CD8-T细胞，能辅助细胞，能辅助B细胞分化成熟生细胞分化成熟生成抗体产生细胞成抗体产生细胞桨细胞，参桨细胞，参与促进细胞介导与促进细胞介导的免疫应对。的免疫应对。一淋巴细胞及其亚群分析一淋巴细胞及其亚群分析2 2、TcTc细胞：细胞： CD3+

20、CD3+ CD4 - CD8 +T CD4 - CD8 +T细胞，细胞，能特异性直接杀伤能特异性直接杀伤靶细胞，一切表达靶细胞，一切表达MHC IMHC I类分子的靶类分子的靶细胞。抗肿瘤免疫，细胞。抗肿瘤免疫，抗病毒感染，移植抗病毒感染，移植排斥反响和本身免排斥反响和本身免疫疾病中均起了重疫疾病中均起了重要作用。要作用。 B B细胞约为细胞约为5%-10%5%-10%，标志，标志为为BCRBCR，膜外表免疫球蛋白，膜外表免疫球蛋白SmlgSmlg。表达。表达CD19CD19、 CD20CD20、CD21CD21、CD22CD22分子。分子。B B细胞也是免疫系统重要细胞也是免疫系统重要的免疫

21、细胞，主要功能是的免疫细胞，主要功能是介导体液免疫。抗原递呈介导体液免疫。抗原递呈细胞，能摄取、加工和递细胞，能摄取、加工和递呈抗，同时还能分泌细胞呈抗，同时还能分泌细胞因子调理免疫应对。因子调理免疫应对。( (二二B B淋巴细胞及其亚群淋巴细胞及其亚群 自然杀伤细胞自然杀伤细胞Natural killer cell,NK Natural killer cell,NK 细胞为一细胞为一组大颗粒的淋巴细胞，组大颗粒的淋巴细胞，5%-10% 5%-10% 左右，标志左右，标志CD16CD16、CD56CD56、CD2CD2、CD11a/CD18CD11a/CD18。用三色荧光标志将。用三色荧光标志将CD3-CD16+CD56+CD3-CD16+CD56+淋巴淋巴细胞定为细胞定为NKNK细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用。抗病毒感染中均起重要作用。三三NKNK细胞分析细胞分析 一细胞介导细胞毒性实验一细胞介导细胞毒性实验二细胞内细胞因子测定二细胞内细