实验9.2基因组DNA提取与PCR扩增

1、二、实验原理二、实验原理 使用消化缓冲液使使用消化缓冲液使DNA从细胞内释放出来，从细胞内释放出来，65度温育可以加速度温育可以加速DNA溶解，酚溶解，酚氯仿异戊氯仿异戊醇抽提可以将蛋白质与醇抽提可以将蛋白质与DNA分离，冷的异丙醇分离，冷的异丙醇沉淀沉淀DNA，70的乙醇洗去的乙醇洗去DNA表面的残留表面的残留有机溶剂。有机溶剂。PCR及有关技术的发展历史（及有关技术的发展历史（4）PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200

2、umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L1 12 23 34 45 52222555572729494时间（时间（minmin）温度温度（）PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1 13 3步步25253030轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以

3、上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍1 12 23 34 45 52222555572729494时间（时间（minmin）温度温度（）适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1313步步25302530轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链模板模板DNADNA95955050

4、引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物7272TaqTaq酶酶TaqTaq酶酶第第1 1轮结束轮结束9595第第2 2轮开始轮开始50507272TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq7272第第2 2轮结束轮结束模板模板DNADNA第第1 1轮扩增轮扩增第第2 2轮扩增轮扩增第第3 3轮扩增轮扩增第第4 4轮扩增轮扩增第第5 5轮扩增轮扩增第第6 6轮扩增轮扩增n（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。进行嵌合、缺失、点突变等改造

5、。n（三）（三）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析 由于由于PCRPCR技术具有高度敏感性，故可用技术具有高度敏感性，故可用于微量于微量DNADNA和和RNARNA的分析检测。的分析检测。 n（四）（四）DNADNA序列测定序列测定n（五）基因突变分析（五）基因突变分析重要的重要的PCRPCR衍生技术衍生技术1 1 不对称不对称PCRPCR2 2 3 3 反转录反转录PCRPCR技术技术4 4 6 gene-Walking(6 gene-Walking(步移步移PCR) PCR) 7 7 原位原位PCRPCR技术技术8 8 实时实时PCRPCR技术技术( ( 荧光定量荧光定量 P

6、CR,real-time PCR)PCR,real-time PCR)9 9 易错易错PCRPCR10 tail-PCR10 tail-PCR11 11 搭桥搭桥PCRPCR12 12 锚钉锚钉PCRPCR13 13 多功能接头多功能接头PCR(versatile cassette PCR)PCR(versatile cassette PCR)、Alu PCRAlu PCR、热不对称交错、热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCRPCR(thermal asymmetric interlaced PCR）. .PCRPCR实验药品与设备实验药品与设备

7、p dNTPsp Taq或高保真或高保真DNA聚合酶聚合酶p 相应的相应的PCR buffer p DNAp 移液器移液器/PCR扩增仪扩增仪/电泳仪等电泳仪等主要设备主要设备仪器名称厂家PCR仪Applide Biosystems高压灭菌锅HIRAYAMA电泳仪Bio-Rad凝胶成像系统Bio-Rad超净工作台AIRTECH微孔滤膜生工生物工程（上海）有限公司基因枪及各配件Bio-Rad恒温摇床哈尔滨东联技术开发有限公司低速离心机Thermo恒温培养箱韶关泰宏医疗器械有限公司表表2 实验中使用的主要仪器实验中使用的主要仪器实验步骤实验步骤成分使用量全式金Taq 酶（预混）25l上游引物1l下

8、游引物1l总基因组1lddH2OUp to 50lPCR扩增扩增以全基因组为模板，利用目的以全基因组为模板，利用目的基因引物进行目标片段的扩增。反应体系如基因引物进行目标片段的扩增。反应体系如下：下：实验步骤实验步骤PCR扩增扩增以全基因组为模板，利用目的以全基因组为模板，利用目的基因引物进行目标片段的扩增。基因引物进行目标片段的扩增。PCR扩增目的片段扩增目的片段 目的片段通常通过目的片段通常通过PCR获得，引物设计要保证目的片段两获得，引物设计要保证目的片段两端有端有至少至少15bp序列与线性化载体的两端一致序列与线性化载体的两端一致，特殊应用引物，特殊应用引物设计请参照技术手册。为保证设计请参照技术手册。为保证PCR扩增的特异性及灵敏度，扩增的特异性及灵敏度，请尽可能选用请尽可能选用pfu等高保真酶。等高保真酶。PCR每条引物长度至少在每条引物长度至少在35-40bp，包括，包括5端与载体同源的端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列以及目的片段特异性序列20-25bp。实验步骤实验步骤引物设计引物设计pUC19 Lin