庆大霉素对羟基磷灰石_壳聚糖复合材料性能的影响

1、收稿日期:2009-07-27。收修改稿日期:2009-10-16。国家自然科学基金课题(No.30872404,30828028,广东工业大学“211”培育项目资助。*通讯联系人。E -mail :tjycai ,Tel/Fax :020-*第一作者:赵宏霞,女,36岁,博士研究生;研究方向:生物材料。庆大霉素对羟基磷灰石/壳聚糖复合材料性能的影响赵宏霞1,2金花1蔡继业*,1(1暨南大学生命科学院,广州510632(2广东工业大学轻工化工学院,广州510090摘要:羟基磷灰石/壳聚糖-庆大霉素(HA/CS -G缓释材料为骨髓炎的定点缓释给药提供了一种有效的局部药物缓释体系。为了研究抗生素对

2、羟基磷灰石/壳聚糖材料性能的影响,采用共沉淀法制备了HA/CS -G 缓释材料。利用红外光谱(IR、X 射线衍射(XRD和扫描电子显微镜(SEM对材料进行了表征。以不载药的羟基磷灰石/壳聚糖(HA/CS为对照,研究了庆大霉素对HA/CS 复合材料抑菌性能、力学性能和降解性能等的影响。实验结果表明,HA/CS -G 有良好的抑菌效果。负载庆大霉素后HA/CS 的机械强度明显增强,而材料的降解速率有所下降。本文采用的二次成型技术显著增大了材料的机械强度。关键词:壳聚糖;羟基磷灰石;庆大霉素;局部药物缓释体系中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:1001-4861(201001-0106-06

3、Effects of Gentamicin on Properties of Hydroxyapatite/ChitosanZHAO Hong -Xia 1,2JIN Hua 1CAI Ji -Ye *,1(1College of Life Science and Technology,Jinan University,Guangzhou 510632(2Faculty of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University and Technology,Guangzhou 510090Abstract:Antibioti

4、c -loaded hydroxyapatite/chitosan (HA/CSwas always used as a drug delivery system (DDSto cure osteomyelitis.In this paper,gentamicin(Gwas loaded on HA/CS materials to prepare a DDS.The products were characterized by Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR,X -ray diffraction (XRDand scanning

5、electron microscope(SEM.This paper reported on comparison of chemical property and antibacterial activity between HA/CS -G and HA/CS.Comprising with HA/CS,HA/CS -G exhibited much higher compressive strength and better antimicrobial activity.Moreover,molding technique of uniaxial pressure following c

6、old isostatic pressure gave materials much higher compressive strength than technique of cold isostatic pressure.HA/CS -G can be used as an ideal gentamicin carrier and has great potential in osteomyelitis therapy.Key words:chitosan;hydroxyapatite;gentamicin;drug delivery system在骨髓炎的治疗中,局部药物缓释体系(dru

7、g delivery system,DDS被公认为一种有效的方法之一,它具有局部药物浓度高,血药浓度低,缓慢释放,持续时间长等优点1-4。在DDS 的制备中,药物载体的选择至关重要,它直接影响了DDS 的缓释行为和治疗效果。研究者先后利用了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA、聚乳酸(PLA、聚乙二醇(PGE、磷酸钙骨水泥、纤维蛋白凝胶、胶原蛋白等作为药物载体,用于DDS 的制备5-10。羟基磷灰石/壳聚糖(hydroxyapatite /chitosan ,HA/CS是目前公认的一种理想的骨修复材料,也是一种理想的药物载体,能负载抗生素用于骨髓炎的防治。而庆大霉素(genmatycin ,G是临床常用

8、第26卷第1期2010年1月Vol .26No .1106-111无机化学学报CHINESE JOURNAL OF INORGANIC CHEMISTRY第1期赵宏霞等:庆大霉素对羟基磷灰石/壳聚糖复合材料性能的影响的一种抗生素,可用于骨髓炎的治疗11-15。羟基磷灰石/壳聚糖-庆大霉素(HA/CS-G缓释材料为骨髓炎的定点缓释给药提供了一种有效的局部药物缓释体系。用于骨髓炎防治的DDS除了要求具备良好的抑菌性能外,还要求材料具有良好的机械强度和降解性能。虽然有研究报道了万古霉素会引起骨水泥材料的机械强度降低16,但抗生素G的载入对骨替代材料的机械强度会造成怎样的影响仍未见报道。本文首次研究了

9、G对HA/CS材料机械强度和降解性能的影响。冷等静压成型技术目前应用广泛17-19,与传统的单轴干压成型相比,前者能使材料获得更高的机械强度。本文则利用了二次成型技术对材料进行成型,即将材料单轴干压成型后再进行冷等静压成型,并通过材料机械强度检测实验研究了这种二次成型技术是否能使人工骨材料获得比单纯的冷等静压成型技术更好的机械性能,这一工作目前尚未见报道。1材料与方法1.1试剂壳聚糖:脱乙酰度90%,粘均分子量4.06×105,上海伯奥生物科技有限公司;硫酸庆大霉素,湖北天药药业有限公司;硝酸钙,磷酸氢二铵,氨水,氢氧化钠,硫酸均为分析纯;牛肉浸膏,蛋白胨,琼脂均为生化纯。1.2材料

10、的制备及成型以0.50mol·L-1的Ca(NO32溶液和0.30mol·L-1的(NH42HPO4溶液为前体制备HA,以氨水调节溶液pH值为10,陈化24h。所得的沉淀经洗涤、干燥后得HA粉体,研磨备用。取HAP浆料(含水率83%与3%的CS溶液(溶剂为2%的稀乙酸按73的质量比共混、搅拌至具有适当黏度的复合浆料。参照文献20关于羟基磷灰石类载G缓释材料的制备方法,将庆大霉素以125质量比加入到上述的HA/CSP复合浆料中,边搅拌边用氨水调节其溶液的pH为7.4左右,复合浆料在碱性溶液中凝聚,继续均匀搅拌5min,于40干燥,制得HA/CS-G缓释材料。上述方法若不加庆大

11、霉素则制备得到HA/CS材料。若以上述方法单以HA为载体则得到载庆大霉素-羟基磷灰石(HA-G材料。本文利用了两种方法对材料进行成型:一种方法利用了单纯的冷等静压成型技术(250MPa压力,另一种方法则利用了二次成型技术,即单轴向干压成型(施以单轴向200MPa的压力后再冷等静压对材料进行成型,制成高13mm,半径为5mm的圆柱体。1.3G对材料抑菌性能的影响MH琼脂上培养金黄色葡萄球菌,分别取0.5g HA/CS-G,0.5g HA-G和0.5g HA/CS压成直径为10mm的药粒,放于琼脂上在37下培养。测不同天数时抑菌圈直径,每次3个样品,取平均值。每次检测后将抑菌材料置于新更换的培养了

12、金黄色葡萄球菌的琼脂。以相同的方法培养大肠杆菌,并实验上述3种材料进行对大肠杆菌的抑菌效果。1.4HA/CS-G材料的表征及机械强度测试利用FTIR(EQIOMOX55,BRUKER公司、XRD (XD-2,北京普析通用公司和SEM(JSM-6700F,日本JEOL公司对材料进行表征。以万能材料试验机(Zwick/Roell Z005,德国测材料的抗压强度,每种材料取8个样品测试,取平均值。1.5HA/CS-G的体外降解实验取HA/CS-G或HA/CS,称重材料的初始重量W1,将样品置于100mL PBS模拟体液中,每组材料平行取6个样品。每隔5d将样品从浸泡液中取出后。干燥后称得材料的干重W

13、2,以公式L=(W1-W2/ W1计算样品的失重率L。称量后更换浸泡液,将样品重新放回浸泡液中继续浸泡降解。2结果与讨论图1为HA/CS-G材料成型后的照片,采用了单轴干压后再冷等静压的二次成型技术。从外观观察,材料表面光滑,形状规则。2.1HA/CS-G的化学性质分析图2是HA/CS-G的XRD图,从图中可看到,在图1HA/CS-G样品Fig.1Samples of HA/CS-G107第26卷无机化学学报10.9°和19.1°附近出现CS的2个特征衍射峰,21.6°和31.8°的衍射峰为HA的(002和(211的特征衍射峰,从衍射峰的锋锐程度可知该H

14、A呈弱结晶状态。图3中左图是HA/CS-G以及HA/CS的IR图谱。从图中看到,HA/CS在1035、976、609及566cm-1存在PO43-伸缩振动峰。与不负载G的HA/CS相比, HA/CS-G样品的PO43-的特征吸收峰(1061、990、602、584cm-1的强度没有明显的减弱。3743和1652cm-1附近的吸收峰分别是由吸附水和O-H伸缩振动产生。与HA/CS相比,HA/CS-G样品的1652cm-1处吸收增强,说明-OH的含量增加。这是由于G分子结构中有多个-OH,G负载于HA/CS后使材料的-OH的含量增大,导致1652cm-1处-OH 吸收峰的吸收增强。与HA/CS相比

15、,HA/CS-G的IR 图谱中1228cm-1处C-N伸缩振动峰以及1127和793cm-1处N-H弯曲振动峰显著增强,这是因为复合材料中的氨基糖苷类抗生素G分子结构中含有多个氨基。右图中3460cm-1处是HA/CS的氨基伸缩振动吸收峰。在负载了G后,由于G分子中的氨基与CS上醚氧基等基团形成的氢键作用,3460 cm-1处裂分成多个吸收峰。2.2HA/CS-G的形貌观察图4是HA/CS-G和HA/CS的SEM图,其中a 图和b图分别是HA/CS-G材料表面及截面形貌,c 图和d图分别为HA/CS材料表面及截面形貌。从图中可知这两种材料表面及内部均呈多孔结构。孔的形状多样,孔隙尺寸在数微米范

16、围,孔的贯穿性良好。CS分子中存在羟基和氨基,可借氢键或离子键形成具有类似网状结构的笼形分子,从而使得复合材料具备了类似三维网状结构,含有大量相互贯穿的孔洞,材料孔隙率较高21-22。图2HA/CS-G的XRD图Fig.2XRD pattern of HA/CS-G 图3HA/CS-G和HA/CS的FTIR图谱(左图以及HA/ CS-G与HA/CS的氨基吸收峰比较(右图Fig.3FTIR of HA/CS-G and HA/CS(leftand comparison on FTIR in NH region of these samples(righta:HA/CS-G surface(

17、15;3000;b:HA/CS-G section(×2000;c:HA/CS surface(×3000;d:HA/CS section(×3000图4HA/CS-G和HA/CS的表面及截面SEM图Fig.4SEM image of HA/CS-G and HA/CS2.3HA/CS-G的抑菌性能从图5的a和b图可知,未载药的HA/CS复合材料自身对金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌均有一定的抑菌作用,其抑菌作用缘于材料中CS的抗菌性能,但HA/CS的抑菌作用只能维持910d,且抑菌圈较小,说明其抑菌活性不高。当负载抗生素G后,材料的抑菌性能明显增强。无论是金黄色葡萄球

18、菌还是大肠杆菌,负载了G的HA/CS-G缓释材料的抑菌性能明显高于不载药材料HA/CS。当G从材料中的缓慢释放出来,在金黄色葡萄球或大肠杆菌的培养基上形成了抑菌圈。抑菌圈随着培养天数的延长而缓慢减小。第1d时抑菌圈最大,分别为45和41mm,随着时间的延长,抑菌圈慢慢缩小,到第18d,抑菌圈仍分别有32和21mm。结果表明载药108第1期赵宏霞等:庆大霉素对羟基磷灰石/壳聚糖复合材料性能的影响HA/CS具有良好的杀菌抑菌功能,能在较长时间持续维持对细菌的抑制作用,这对手术后骨髓炎的预防和治疗有十分重要的意义。同时,从图C中可看到,与大肠杆菌相比,该载药缓释材料对金黄色葡萄球菌有更强的抗菌作用。

19、这一结果表明该缓释材料对革兰氏阳性菌的抑菌作用高于对革兰氏阴性菌的抑菌作用。2.4G对材料机械强度的影响本实验中HA/CS-G和HA/CS的材料成型都利用冷等静压以及单轴干压后再冷等静压两种成型方法。图6是经两种不同方法成型后两种材料的抗压强度。从图中可知,经单轴干压后再冷等静压的二次成型技术所获得的HA/CS-G材料抗压强度明显高于单纯冷等静压成型的HA/CS-G。同样,经二次成型的HA/CS材料抗压强度也明显高于单纯冷等静压成型的HA/CS。由此可见材料的成型技术对载药缓释材料及骨修复材料的机械强度均有显著影响,上述二次成型技术能使材料获得良好的机械强度。杨玉辉等人报道载药骨水泥在负载万古

20、霉素后,材料的机械强度有所降低16。从图6中可知HA/ CS-G的抗压强度达58.5GPa,强度已达到密质骨的力学要求。HA/CS-G的强度明显高于HA/CS,说明G 的载入能有效提高材料的强度。这与G和CS之间形成氢键有关。G是氨基糖苷类抗生素,其分子中有多个-OH和-NH2,能作为质子给予体与CS分子结构的羰基、醚氧基等基团形成氢键;而G分子结构中的多个醚氧基则作为质子接受体,与CS分子上的-OH和-NH2形成氢键。图2中IR图谱中,3460cm-1处为HA/CS的氨基伸缩振动吸收峰,在负载了G 后,裂分成多个吸收峰,证明了G分子的氨基与CS图5HA/CS-G和HA/CS的抑菌性能比较Fi

21、g.5Antibacterial activity of HA/CS-G and HA/CS against S.aureus(Fig.aand E.coli(Fig.b.The diameters of these drug cylinders were all in10mm.Comparing with HA/CS,HA/CS-G had much better antimicrobial activity.Fig.c was comparison on antibacterial activity of HA/CS-G against E.coli and S.aureus.HA/CS-

22、G had betterantibacterial activity against Gram-positive bacteriaComparing with HA/CS,HA/CS-G exhibited a higher compressivestrength.Moreover,molding technique of cold isostatic pressureafter uniaxial pressure gave materials much higher compressivestrength than technique of isostatic pressure图6HA/CS

23、-G和HA/CS的抗压强度比较Fig.6Compressive strength of HA/CS-G and HA/CS109第26卷无机化学学报之间的氢键作用。大量氢键的形成提高了材料的物理交联密度,从而有效地增强了材料的机械强度。由此可见,从材料机械强度角度考虑,材料负载抗生素G更优于负载万古霉素。2.5G对材料降解性能的影响单纯的HA生物降解速度较慢,难以与骨缺损部分的修复速度相协调,这就限制了HA的临床应用。唐佩福等人研究了HA的降解性能,实验结果表明在体外浸泡12周后HA的失重率也仅为1.4%23。为解决这一问题,常利用合成或天然高分子化合物与HA复合来改善材料的相关性能。HA属于

24、难溶盐,溶解度非常低,当与CS复合后,HA的结晶度降低,溶解度增大24-25,从而使其降解性能得到改善。从图7可知HA/CS的降解速率较高,降解性能良好,在模拟体液中浸泡30d后,失重率为22.7%。当负载G后,HA/CS-G材料在模拟体液中浸泡30d后,失重率为14.8%,比HA/CS的降解速率有所减缓,这和G与CS之间的氢键作用有关。一般认为,骨材料的降解开始于表面的溶解和膨胀,随后材料的结构变得疏松,表面积增大,粒子扩散速率加快。这些都与材料的亲水性有关,材料亲水性越大,降解速率越快。随着G的加入,CS分子中六元环上更多的亲水基团(羟基和氨基参与了与G 中的氨基、羟基之间氢键作用。氢键作

25、用限制了CS 的吸水膨胀,也减小了吸水空间,吸水性下降,从而使材料的降解速率降低。虽然吸水性的降低导致HA/CS-G降解速率有所下降,但总的来说HA/CS-G 仍具有良好的降解性能,作为骨植入材料具有良好的应用前景。3结论良好的机械性能是骨植入材料必须具备的一个基本要求。本文采用的单轴干压后再冷等静压的二次成型技术能使材料获得良好的机械强度,这为骨修复材料的加工成型提供了一种有效可行的方法。HA/CS-G缓释材料的良好抑菌效果及缓释规律使其在骨髓炎治疗可作为一种有效的局部药物缓释体系。抗生素G的负载不仅使HA/CS材料获得了良好的抑菌效果,也使得HA/CS-G复合材料的机械强度显著提高,因此H

26、A/CS-G在骨缺损修复以及骨髓炎的防治中显示出了极大的临床应用潜能。参考文献:1Kyriaki K,Evangelos J,Giamarellos B,et al.Drugs,2000,59(6:1223-12322CHEN Hong-Wei(陈红卫,HUANG Hong-Bin(黄洪斌,ZHAO Gang-Sheng(赵钢生,et al.China J.Orthop.Traum.(Zhongguo Gushang,2008,21(1:79-813Radin S,Cam pbell J T,Ducheyne P,et al.Biomaterials,1997,18(8:777-7824Hab

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