明胶联合VEGF内衬血管壁防止股动脉血管成形术后狭窄的实验研究

1、明胶联合VEGF内衬血管壁防止股动脉血管成形术后狭窄的实验研究               作者：蒋鸥 王志刚 乔正荣 时德【摘要】目的：评价血管重建术后内衬明胶和内皮细胞生长因子（VEGF）受损血管壁对防止血管狭窄的效果。方法：建立兔股动脉再狭窄动物模型，实验组内衬浓度为30%的明胶及VEGF于损伤段动脉壁，分别于2周和4周采集标本，行图像分析及TUNEL原位杂交，比较实验组与对照组内膜面积（NEA）、内中膜面积比（NEA/MA）和平滑肌细胞凋亡率，电镜观察平滑肌

2、细胞的增生及凋亡情况。结果：对照组较实验组新生内膜厚，而且细胞数也明显多。对照组NEA2周及4周分别为（1.02±0.41）和（1.46±0.15）mm2比实验组分别为（0.57±0.15）和(1.18±0.36)mm2大。NEA/MA对照组2周及4周分别为（0.54±0.14）和(0.75±0.10)也明显高于实验组分别为(0.35±0.05)和（0.62±0.25）。TUNEL阳性细胞率对照组2周为（13.6±2.4）%,4周为（15.1±2.1）%，治疗组分别为（18.2±5.8

3、）%和（17.0±1.5）%。电镜观察发现对照组平滑肌细胞明显增生，细胞器发达，肌丝较多，而实验组见较多的凋亡小体有髓样结构形成。结论：提示明胶联合VEGF内衬血管成形术后的血管内壁对血管再狭窄有明显的抑制作用。   【关键词】血管狭窄明胶内皮细胞生长因子内皮，血管兔   Investigation of vascular wall lined by Glutin and VEGF to prevent rabbit femoral arteries from restenosis after angioplasty   【

4、ABSTRACT】Objective:To evaluate the effectiveness that glutin and VEGF line the injured vasucler wall to prevent the drteries from restenosis.Methods:To build animal model of restenosis by balloon dilation in femoral artery.30 percent of glutin and VEGF were lined on injured vascular wall in the expe

5、riment,and samples were collected at 2 weeks and 4 weeks respectively.By imagine analysis system and DuTP nick end labeling,to compare neointimal area and neointimal area / media area of the control group with those of the experment group.The hyperplasia and the apoptosis of the vascular smooth musc

6、le cells were obsenved by electron microscopy.Results:Intima of the control was thicker thanthe experiment group,and the control group had the more number of cells than the experiment group.From the morphology,neointimal area were reduced significantly in the experiment group(which was 0.67±0.2

7、5mm2 at the 2 weeks and 1.18±0.36 mm2 at the 4 weeks respectively)compared with the control group(which was 0.67±0.25 mm2 at the 2 weeks and 1.18±0.36 mm2 at the 4 weeks).Furthermore,NEA/MA of the experimetn group(which was 0.35±0.05 at 2 weeks and 0.62±0.25 at 4 weeks)was l

8、ower than that of the control(which was 0.54±0.14 at 2 weeks and 0.75±0.10 at 4 weeks).The experiment group had the higher ratio of positive cells marked by TUNEL(which was 13.6±2.4% at 2 weeks and 15.1±2.1% at 4 weeks)than the control group(which was 18.2±5.8% at the 2 week

9、s and 17.0±1.5% at 4 weeks).Conclusion:It is effective to prevent artery from restenosis that glutin lines the injured vasucler wall.   【KEY WORDS】RestenosisGelatinEndothelial growth factorsEndothelium,vascularRabbits   目前各种血管成形术后再狭窄率达30%40%1，严重地影响手术的远期效果。目前对再狭窄的研究正转向促进血管内皮细

10、胞的修复和功能恢复2。本实验采用明胶及血管内皮细胞生长因子（VEGF）联合内衬血管内膜，观察对促进血管内皮细胞的修复和功能恢复的作用，为防止和减轻血管重建术后的再狭窄提供治疗依据。   1  材料与方法   1.1  实验动物及分组  成年日本大白兔40只,体重2.53.0kg。采用完全随机分组设计，每组10只动物。分为对照组A（2周取材）、对照组B（4周取材）、实验组A（2周取材）和实验组B（4周取材）。对照组为球囊扩张组，实验组为球囊扩张+明胶内衬组。采用10%异戊巴比妥钠1.5ml/kg加氯氨酮5mg/kg麻醉动物。&

11、#160;  1.2  主要试剂  VEGF10g(PeproTech EC Ltd.),TUNEL检测试剂盒（武汉博士德公司）。   1.3  实验方法   1.3.1  大白兔股动脉血管内球囊扩张方法  见文献3。   1.3.2  实验组明胶联合VEGF内衬血管内壁制作方法  动物在球囊扩张后重新阻断损伤段动脉远心端，经切口植入直径1mm的硅胶管，在切口下端用硅胶带将血管与硅胶管一起扎住从而使损伤段近心端动脉封闭，将混合液注入损伤段动脉内保留2min

12、后再抽出明胶，缝合动脉。混合液为30%明胶和VEGF 50ng/ml。   1.4  标本采集与制作  实验动物喂养2周及4周后取材。切取缝线下端约5cm动脉标本，采用1%PPS平衡液冲洗血管腔内残留血液，石蜡包埋，切片，HE染色，弹力纤维染色，TUNEL原位杂交，计算机图像分析，电镜观察。   1.5  损伤血管细胞凋亡的计算  正常血管内膜细胞核呈蓝色，而凋亡血管内膜细胞核呈棕黄色，在光学显微镜下计算5个高倍视野（×400）中VSMCs（血管平滑肌细胞）凋亡细胞占该视野VSMCs总数的比例，求其均值。

13、   1.6  统计学方法  实验数据进行两样本均数间的t检验，计量资料用x±s表示，率的比较用2检验。P0.05为差异有统计学意义。    2  结  果   2.1  计算机图像分析  见表1。表1  新生内膜面积（NEA）、新生内膜/中膜面积比（NIA/MA）对照组2.2  TUNEL染色结果  见表2。表2  TUNEL阳性细胞率结果提示明胶联合血管内皮细胞生长因子内衬血管壁促进了血管平滑肌细胞凋亡。

14、0;  2.3  电镜观察  透射电镜可见实验组平滑肌细胞出现较多的空泡（凋亡早期改变）及凋亡小体，核膜髓样结构形成（图1A上），胞质浓缩，核有碎裂（图1A下）。对照组VSMC呈收缩型或增生型胞核大染色质丰富，胞质内肌丝较多，线粒体高尔基体发达（图1B）。   3  讨  论   PTA、经皮腔内冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA）、支架植入、血管移植、旁路转流术以及血管内膜旋切术等血管成形术是目前较有效治疗动脉闭塞症的手

15、段，即刻成功率可达80%以上。但其中有30%50%的病人术后36月可因血管内膜过度增生而导致血管再狭窄1，4。如何防止血管再狭窄的发生，降低再狭窄率已成为包括心内科、血管外科及介入学科在内的诸多学科的研究重点。            目前在治疗策略上主要应用直接抑制血管平滑肌细胞增殖的方法，如反义癌基因和正义抑癌基因的导入等，但血管平滑肌细胞的增殖是血管形成再狭窄的较晚期反应。现公认血管内皮细胞受损是再狭窄的始动因素。研究发现，血管内皮细胞损伤后局部血小板聚集并释放各种生长因子，如血小板源性生长

16、因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管紧张素等是造成动脉壁平滑肌细胞过度增生的重要因素5。血管内皮细胞的剥脱和修复障碍在再狭窄的形成中起关键作用6。也有研究证实，内皮细胞损伤面积决定新生内膜增厚的程度，内皮细胞最后覆盖区内膜增生最厚，损伤后内皮化的速度对最终形成再狭窄起关键作用7。   VEGF是一种糖蛋白，对血管内皮细胞具有特异性，是一种血管内皮细胞特异性促丝裂原，可以促进损伤内皮细胞的迅速增生，加速损伤内膜内皮化，进而抑制血管平滑肌细胞增殖。VEGF能有效促进血管平滑肌细胞分裂和增殖，有利于损伤内皮的迅速修复，实验研究和临床实验也已证实这点8，9。Asahara等7，10报

17、道，在动物血管狭窄球囊损伤动脉模型中给予VEGF蛋白局部作用30min，2周及4周后，发现治疗组内皮再生情况好于对照组，内膜厚度明显减轻，认为血管内皮细胞修复的同时抑制平滑肌细胞增殖。因此如果通过保护因球囊扩张而受损的血管内壁和尽量加快损伤内壁的修复，我们就可能阻断各种因素对VSMC的刺激从而防止VSMC迁移及增殖，达到抑制内膜过度增生的目的11。   本实验在既往试验所取得结果的基础上3，进一步证实了通过将明胶联合VEGF内衬于受损伤的动脉段将更有助于防止血管再狭窄，抑制平滑肌细胞增生，且较单纯明胶内衬血管壁效果佳，与文献报道一致10，12。该结果为今后开发更能有效黏附于

18、血管壁又能防止血小板在受损内膜集聚、促进血管内皮细胞生长的生物材料提供了依据。   参  考  文  献   1Forough R,Lea H,Starcher B,et al.Metalloproteinase blockade by local overexpression of TIMPlincreases elastin accumulation in rat carotid artery intimaJ.Arterioscler Thromb Vass Biol,1998,18:803807.  

19、; 2Meurice T,Vallet B,Cauters C,et al.Role of endothelization cells in restenosis after coronary angioplastyJ.Fundam Clin Pharmaco,1996,10(3):234242.   3蒋鸥，王志刚，乔正荣，等.明胶内衬血管壁防止兔股动脉血管成形术后狭窄的试验研究J.中国现代普通外科进展，2004，7（6）：347349.   4Dale WE,Batra PS,Blaaine EH,et al.Enhanced neointimal

20、growth in cultured rabbit aorta following in vivo balloon angioplastyJ.In Vitro Cell Dev Biol Anim，1998,34(10):805812.   5Juno Deguchi,Masatoshi Makuuchi,Takashi Nakaoka,et al.Angiotensin stimulated plateletderived growth factorbchain expression in newborn rat vascular smooth muscle cells

21、and neotintimal cells through ras,extracelluar signalregulated protein kinase,cjun nterminal protein kinase mechanismsJ.Circ Res，1999,565574.   6Meurice T,Vallet B,Cauters C,et al.Role of endotheliazation cells in restenosis after coronary angioplastyJ.Fundam Clin Pharmacol,1996,10(3):2342

22、42.   7Liu MW,Roubin GS,King SB.Restenosis after coronary angioplasty potential biologic determinsnts and role initial hyperplasiaJ.Circulation,1989,79:13741384.   8Asahara T,Chen DH,Tsurumi Y,et al.Accelerated restitution of endothelial integrity and endotheliumdependent function after phVEGF165 gene transferJ.Circulation，1996,94(12):32913302.   9Laitinen M,Hartikainen J,Hiltunen MO,et al.Cathetermediated VEG