白细胞预激与非适应性反应的实验研究

1、白细胞预激与非适应性反应的实验研究        核心提示：                 【摘要】  目的 观察中性粒细胞粘附活性和杀伤效应在大鼠严重创伤后的动态变化规律，探讨中性粒细胞致敏与活化不同功能状态下的生物学标记对创伤的预警意义。方法 采用多处骨折和广泛软组织挫伤建立大鼠严重创伤模型，分别于创伤后2、4、8、12、24h不同时相点采集

2、血标本；攻击组于体外LPS攻击PMN模拟“二次打击”；检测各组PMN释放O2-和PMN-EC的粘附活性的变化。结果 创伤组2、4h时相点中性粒细胞体外自发释放O2-自由基量和PMN-EC粘附活性与基础表达值无明显改变，8、12、24h时相点明显增多（P<0.05），而8、12、24h时相点则显示上述指标均较对照组明显增加；LPS攻击组显示各相应时相点O2-自由基释放量、PMN-EC粘附百分率均较其对照组呈不同程度升高；尤其是2、4h时相点较同组其他时相点增加更为明显（P<0.01），且较创伤组明显增加（P<0.01）。结论 创伤早期PMN处于致敏状态，表现为活性氧的释放能力显

3、著增加和PMN-EC的粘附活性明显上调。 【关键词】  创伤 中性粒细胞 预激 致敏 活化 内毒素 大鼠     【Abstract】  Objective  To observate the changes of release O2- of PMN and PMN-EC adhesion activity at rats with multiple trauma.Its valuable that providing theoretical instruction for clinical treatment,and expect

4、ing a new road for prevention and treatment of severe injury by exploring the mechanism and biomarker of PMN priming.Methods  Adopting murine modles of multiple broken-bone and soft tissue injury, the basal levels of PMN O2- release were found in unstimulated PMN harvested from health rats. Sys

5、temic blood was collected at 2、4、8、12、24h after trauma. With LPS challenge the PMN harvested at various times in vitro（second hit）. The methods used in the study are as follows: 1. In vitro release O2- of PMN was messured by ultraviolet spectroscopy. Results  PMN-EC adhesion activity and sponta

6、neous in vitro O2- release by PMN harvested from trauma rats at 2 and 4hours after injury was also quite low.In contrast, which modestly increased at 8,12 and 24 hours after injury (P<0.05), the above changes all remained higher than that of control group at 8,12 and 24hours after injury. Also, L

7、PS challenge PMNs that expressed more O2-than control,especialy significant elevations at 2 hours、4 hours after injury,compared with control group,PMN-EC adhesion activity all were markedly enhanced at various times after injury,especialy the denotes data at 2 and 4 hours,that are significantly diff

8、erent (P<0.01) from the other various times. Conclusion  The injury to PMN was a role of priming early trauma, and PMN become primed for enhanced superoxide release and the up-regulation of PMN-EC adhesion activity.     【Key words】   trauma;neutrophil granulocyte;pri

9、ming;primed;activation;endotoxin;rat     中性粒细胞（PMN）存在三个功能状态，即静息（quiescent）、致敏（primed）、活化（activited）1。机体受到伤害的早期，创伤作为初始刺激对PMN产生预激（Priming）作用使PMN处于致敏状态，对随后的刺激产生应答反应即进入活化或过度活化状态。本实验观察白细胞对创伤预激的非适应性反应的变化规律，为探讨创伤后全身炎症反应综合征（SIRS）的预警意义拓展一个新思路。     1  材料与方法    

10、; 11  实验动物及创伤动物模型制备  健康成年Sprague-Dawley大鼠90只，体重（250±30）g，雌雄不限，由第二军医大学实验动物中心提供。     本实验动物模型参照文献2方法作改进。动物术前12h禁食，自由饮水；伤后不限制进食、饮水。用自制的夹钳夹大鼠的肢体，造成双侧股骨+双侧胫腓骨+双侧肱骨的多发性闭合型骨折和软组织挫伤，建立创伤动物模型。     12  主要试剂及器材  LPS由Sigma公司提供；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为上海前进试剂厂产品；Percoll

11、细胞分离液、Dextran T 500为Pharmacia公司产品； DU-640型紫外分光光度计由美国Beckmen公司生产。     13  实验方法     131  实验分组  创伤组(Trauma) (n=6)：创伤后不同时相点采集血标本分离PMN；LPS攻击组(Challenge) (n=6)：创伤后不同时相点采集血标本分离PMN + 体外LPS (100ng/ml)攻击；对照组(Control) (n=6)：以上各实验组分别设相应的对照；除未致伤大鼠外，余处理方法与各对应实验组相同。

12、60;   132  标本采集  实验动物随机分组(n=6)；分别于创伤后2、4、8、12、24h不同时相点断头活杀采集血标本，经Percoll梯度离心法分离中性粒细胞，制成1×107cells/ml细胞悬液。中性粒细胞的分离及PMN纯度活力鉴定基本方法见Haslett法3，采用Haslett法测定的PMN纯度及活力均>92%。     133  内皮细胞培养及鉴定  采用大鼠主动脉血管组织块贴壁法参考文献4方法作改进。实验所用内皮细胞为传代培养第五代，并经PAP法鉴定因子相关抗原无阴性缺

13、损区。     134  PMN产生O2-自由基的测定  利用紫外分光法检测O2-自由基，根据文献5方法以氧化型NBT（NBT+）间接表示O2-生成量。     135  PMN-EC粘附活性的测定  根据文献6方法检测中性粒细胞与内皮细胞的粘附率表示其粘附活性。粘附率=（粘附前的细胞计数洗脱液细胞计数）÷粘附前的细胞计数×100%。     14  统计学分析  实验结果以均数±标准差（x±s）表示，采用

14、Base统计软件包进行完全随机资料的方差齐性检验（F检验），组间计量资料均数比较均采用t检验。     2  结果     21  创伤后大鼠PMN产生O2-的动态变化  创伤组2、4h时相点PMN释放O2-自由基量无明显变化； 8、12、24h时相点明显高于对照组（P<0.05）；攻击组各时相点O2-自由基量较其对照组均显著升高，尤其是2、4h时相点相差非常显著（P<0.01）；与创伤组相应的时相点比较相差非常显著（P<0.01）（Fig.1）。    

15、22  创伤后大鼠PMN-EC粘附活性的动态变化  创伤组2、4h时相点PMN-EC粘附百分率与其对照组比较无明显变化，8、12、24h时相点明显增加（P<0.05）；攻击组各时相点PMN-EC粘附百分率较其对照组均显著升高，尤其是2、4h时相点升高显著（P<0.01），且明显高于创伤组（P<0.01）（Fig.2）。注：*P<0.05 P<0.01 vs control  *P<0.01 vs 8，12，24h   ）注：*P<0.05 P<0.01 vs control *P<0.01

16、vs 8，12，24h  3  讨论     3. 1  创伤动物模型的建立  自1992年Deitch提出二次打击学说以来，利用二次打击建立标准化的和符合临床实际的创伤后双向迟发MODS动物模型一直是创伤引发SIRS、MODS、MOF研究中的难题7。迄今为止，创伤后MODS动物模型与临床MODS的最大区别在于动物遭受致伤因素打击后没有强有力的器官支持措施，因而难以度过最初的休克或单器官衰竭而早期死亡，使可能发展到MODS的自然过程中断。     本实验参照文献2方法，建立严重创伤（或多发性创伤

17、）动物模型。以创伤作为初始打击，体外用LPS攻击从创伤后大鼠血液中获得的中性粒细胞，以模拟内毒素对PMN的二次打击（second hit）8。实验动物采用同系SD大鼠，个体差异小，采用自制的可控性夹钳为致伤工具，确保各动物的致伤程度一致，以减少系统误差；根据简明创伤分度（AIS）评分四肢多发性长骨闭合型骨折为严重创伤，所以本实验以夹钳致伤大鼠六处骨折和软组织挫伤，造成大鼠的严重创伤作为对机体的第一次打击（first hit），刺激因素较单一，基本排除了象临床上液体复苏、药物治疗等干扰，同时也体现了以动物作为实验对象的优点，更有利于研究工作对实验条件的控制。    

18、 3.2  PMN预激及其功能状态的变化  一个细胞对初次损害有准备称预激（Priming）9，预激是指一个细胞首先接触不利因素并能改变该细胞对随后刺激的应答反应，初始刺激可导致其对损害的构建适应性和损害的非适应性反应，从而表现为细胞的各种功能状态。     PMN存在三个功能状态1，即静息（quiescent）、致敏（primed）、活化（activited）。在生理情况下，由于炎细胞的活化有明显的自限性，机体内中性粒细胞（PMN）的发生、激活、灭活、凋亡都维持在均衡水平。然而，机体受到伤害的早期，创伤作为初始刺激对PMN产生预激作用使PMN

19、处于致敏状态，Hallett10把致敏比如交通路口的“黄、绿灯”，此时细胞信号亮起了“黄灯”，等待更进一步刺激，一触即发，进入活化或过度活化状态；内毒素（LPS）可充当这一过程的触发剂，Gebhard等研究发现多发伤的早期血浆中即可能出现内毒素，而且这是严重创伤引发SIRS和MOF的高危因素11。     有研究提示PMN体外释放O2-自由基量反映其在体循环时的功能状态13。本实验观察到：创伤组2、4h时相点PMN体外自发释放O2-自由基与对照组比较，无明显变化；随着创伤后的时间逐渐延长，8、12、24h时相点PMN释放O2-自由基明显增加，与对照组比较差异有显著

20、性（P<0.05）,表示PMN进入活化状态。攻击组各时相点PMN体外自发释放O2-自由基较对照组均显著升高，尤其是2、4h时相点相差非常显著（P<0.01），与创伤组相应的时相点比较相差非常显著（P<0.01），由此显示PMN已过度活化，而此时相点PMN先前在体即处于致敏状态。结果提示创伤早期PMN致敏状态表现为活性氧的释放能力明显增加；在创伤对PMN预激的基础上再以LPS攻击即进入活化或过度活化状态，其释放O2-自由基有放大效应； PMN 致敏与活化是炎症反应的一个必须的组成部分，同时也给机体造成一个“易损窗” (vulnerable window)。  

21、0;  3.3  PMN致敏与粘附活性的关系  PMN粘附、穿越血管内皮细胞（EC）向炎症部位游走是急性炎症损伤过程的重要特征，是导致组织损伤的先决条件，其分子基础在于PMN与EC表面黏附分子（Mac-1、ICAM-1）的相互作用12。     在PMN静止、致敏、活化三个功能状态的变化过程中，致敏作为PMN活化和过度活化的预备状态，表面黏附分子Mac-1的表达及其粘附活性的变化显得尤为重要。本实验观察到创伤组2、4h时相点中性粒细胞PMN-EC粘附百分率与其对照组值无明显变化， 8、12、24h时相点各指标均呈不同程度上调；而攻击组

22、显示与创伤组相对应的时相点指标均有不同程度升高，尤其是2、4h时相点PMN-EC粘附活性呈同步大幅度上调。由此可见，创伤早期（2、4h），PMN经创伤预激作用后处于致敏状态，PMN与EC粘附的储备力明显增加。     3.4  PMN致敏的机制及其功能调控  初始刺激对PMN的预激作用使PMN致敏，导致其功能变化产生放大效应，这种致敏与再次活化作用不同的细胞内机制，目前尚不清楚，而创伤预激使其信号转导系统的改变更为受到人们的关注13。     胞内Ca2+作为第二信使参与创伤后PMN介导的许多生理、病理过程，是PM

23、N激活、粘附和游走所必需的。磷脂酶C（PLC）激活是信号转导的经典途径，PLC激活后产生双信使IP3、DG，IP3能与内质网/肌浆网（钙库）上作为IP3受体的Ca2+通道结合，导致Ca2+通道的开放，使钙库释放，胞内Ca2+浓度升高；粘附斑14（FA）为细胞与细胞外基质通过整合素介导粘附的一种结构，粘附斑酶（FAK）是整合素信号转导中的关键酶，FAK激活后又可进一步激活多条细胞内的信号转导途径，其中包括使细胞内Ca2+浓度升高。作为第二信使的胞内Ca2+浓度升高是启动Mac-1和细胞色素b558（Cytb558 NADPH氧化酶的亚单位）聚集、动员及转膜、表达的关键因子，使中性粒细胞对刺激产生

24、一系列应答反应，从而表现为致敏、活化或过度活化的不同功能状态；创伤早期对PMN的预激，其胞内Ca2+浓度升高可能是PMN致敏的重要因素之一。     活化的PMN是一把双面刃，既参与机体防御功能和免疫反应，同时又可带来组织的继发性损伤。近年来，通过调控白细胞的功能防止PMN过度活化，使其活化保持在有利于机体的水平上，尤其受到人们的重视。使用钙拮抗剂抑制PMN的过度活化有待进一步研究，期望在白细胞激活的初始阶段调控其功能，减轻由PMN过度活化导致组织器官损伤，对机体产生一定的保护作用。 【参考文献】  1 Hallett MB， Lloyds D. Neu

25、trophil priming: the cellular signals that say amber but not green Immunol-Today. 1995，16(6): 264-268.2 Lu Qi,Jin Dadi,Jin Lijuan. Change of Macrophages, Ability to Phagocytose Apoptotic Cells After Multiple Trauma. Chin J Traumaatol,1999，15(1):29-31.3 Haslett C. Modulation of multiple neutrophil fu

26、nction by preparative methods of trace concentration of bacterial LPS. Am J Pathol，1985，119:101.4 鄂征.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1988.5 Stephen JW, Gerald WK, Albert FL. Superoxide generation by human monocytes and marophages. Am J Hematol，1978，4:1.6 Charo IF. Adhansion of human polymorphonuclear leukocytes yo endothelial monolayers; effects of temperature diralent cations, and chemotactic factor on the strength of adherence measured with a new centrifugation assay. Blood，1985，65(2):473.7 Hu Sen, SHENG Zhi-yong, ZHOU Bao-tong, et al. Study on delay tow-phase multiple organ dysfunction syndro