离体毛囊切片两种制作方法的比较及凋亡检测

1、离体毛囊切片两种制作方法的比较及凋亡检测    【关键词】 体外培养    摘要：目的 对人头皮游离毛囊(HF)切片制作及凋亡检测方法进行比较。方法 分别将石蜡切片法和冰冻切片法应用于游离毛囊；利用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行荧光染色与3，3二氨基联苯胺(DAB)染色, 检测未经培养的游离毛囊及培养5d的游离毛囊的不同部位凋亡细胞情况。结果 在对游离毛囊形态检测中，各组毛囊在外根鞘(ORS)，毛球(HB)下部，真皮鞘(DS)及毛乳头(DP)中的凋亡细胞数并无显著性差异(P>0.05)。结论 冰冻切片法

2、应用于游离毛囊简单有效， TUNEL原位荧光结合DAB染色适合于检测毛囊细胞凋亡情况。 关键词：毛囊；体外培养；凋亡 Comparison of two methods of section making and detection of apoptosis method on human scalp hair follicle in vitro ABSTRACT: Objective To compare two methods of section making and to detect the apoptosis on human hair follicle(HF) in vitro.

3、 Methods The paraffin section and frozen section methods were used. The TUNELfluorescence staining and 3, 3Diaminobenzidine(DAB) staining was used to investigate the apoptotic cells of different parts when the hair follicles were uncultured and cultured on 5th day. Results The process of making froz

4、en section was more simple and feasible on single hair follicle. The apoptotic index of outer root sheath(ORS), lower part of hair bulb(HB), the dermal sheath(DS) and dermal papilla(DP) of every groups had no difference(P>0.05). Conclusion The method of frozen section was more feasible on the sec

5、tion making of single hair follicle. The TUNEL with fluorescence staining and DAB staining was suitable for the detection of apoptotic status of hair follicle. KEY WORDS: hair follicle; culture in vitro; apoptosis 毛囊的凋亡现象与毛囊的周期性生长关系密切。虽然与毛囊相关的生物学研究广泛开展,但对毛囊凋亡的系统研究仍不多。以往对生长期与休止期毛囊凋亡现象的探讨主要以定性讨论为主。在本实

6、验中,我们试图采用原位末端标记技术对不同部位毛囊细胞的凋亡情况做一描述。以前的研究中我们曾采用冰冻切片机进行了游离毛囊切片的制作，显现出有别于石蜡切片的优越性1。在本实验中，我们还试图比较石蜡切片法与冰冻切片法在毛囊细胞凋亡检测中的优缺点。    1 材料与方法 1.1 人头皮游离毛囊培养模型 标本来源于整形外科除皱头皮切口周边头皮(年龄18-45岁)。培养基成分和模型构建参见文献2。    1.2 游离毛囊冰冻切片的制作 游离毛囊分为未经培养的游离毛囊和培养5d的游离毛囊两组，每组12个毛囊。在倒置显微镜下选取无

7、损伤的游离毛囊，固定后，200g/L蔗糖溶液浸泡24h，在-29下，先将样品盘上的冰冻包埋剂 (optimal cutting temperature, OCT)修出一平台，再用无损伤镊将毛囊以垂直刀口方向(毛球部朝向刀口)放在已修出的平台上，然后以OCT覆盖，冷冻10min后作4m厚的冰冻切片，边切边在显微镜下观察，以便获得游离毛囊完整的中心纵剖面。 1.3 人头皮游离毛囊石蜡切片的制作 选取形态好的游离毛囊，用Bouin固定液固定30min，乙醇脱色，15g/L琼脂加热溶化并冷却到50时将组织放入浸泡, 待琼脂完全凝固后，将内有毛囊的琼脂用刀片修成5mm3左右的长方形小块，再固定30min

8、后，按梯度进行脱水，二甲苯透明，常规包埋，再以石蜡切片机修整后，调整角度，切成7m左右的切片，HE染色。 1.4 原位细胞凋亡检测 采用原位细胞凋亡检测试剂盒，DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，用原位荧光染色结合DAB染色进行分析，对毛囊Auber限界线下的毛球部、毛囊外根鞘细胞、毛囊真皮鞘及毛乳头细胞进行分析。计数各毛囊切片的不同部位的凋亡指数(阳性细胞数/细胞总数×100%)。 1.5 统计学处理 数据输入SPSS11.0进行分析，各组数据经KolmogorovSmirnov检验P>0.05，尚不能认为各组样本来自的总体不服从正态分布，且各组数据经Levene方

9、差齐性检验P>0.05。故运用t检验进行分析。 2 结果 2.1 游离毛囊的基本结构特征 冰冻切片形态：HE染色后在光学显微镜下可见毛皮质、内皮根鞘、外皮根鞘（ORS）及真皮鞘(DS)等清晰结构；各层间连续性较好，分离较少。整个毛球（HB）部边缘平整，结构清楚，核浆比例大，细胞形态清晰。毛乳头（DP）边界清楚圆滑，呈梭形。内根鞘呈粉红色连续带状，紧贴于毛小皮。外根鞘细胞较多，核深染。真皮鞘中可见少量的成纤维细胞，与外根鞘分离较少。 石蜡切片形态：可分辩出各层的大体结构，但各层之间有明显的分离，靠近毛干侧分离严重。整个毛球部边缘不规整，结构混乱，细胞形态不清晰。毛乳头边界不清。内皮根鞘不完

10、整，中间有较多中断，且与毛小皮有明显的分离（图1）。外根鞘细胞层次少，与真皮鞘有非常明显的分离。真皮鞘呈条带状与其他结构完全分开。    图1 正常人头皮游离毛囊的形态（略） Fig.1 The status of normal human scalp hair follicle a: frozen section method; b: paraffin section HE 10×10 2.2 凋亡状况的光镜观察结果 在加入荧光素dUTP后，加入转化剂POD之前，在500-550nm波长荧光显微镜下可见到以蓝色荧光激发出的绿色荧光的阳性结果(

11、图2a)；加入转化剂POD后DAB显色，苏木素复染后可见棕色的阳性细胞和蓝色的阴性细胞(图2b)。未经培养的生长期游离毛囊的凋亡情况：生长期毛囊的TUNEL阳性结果主要围绕角化的毛皮质成“袋状”结构分布，可见于内根鞘Henle层、Huxley层、外皮根鞘内侧；而真皮组织鞘及毛乳头中，均少见阳性染色。而头皮切片中的毛囊细胞凋亡情况与未经培养的游离毛囊细胞凋亡情况相似。培养5d的游离毛囊TUNEL阳性细胞分布部位及数量与未经培养的游离毛囊相似。未经培养的退行早期游离毛囊镜下可见：在外皮根鞘的广泛区域内均有一定数量的阳性细胞。母质区、母质上区、上皮索、毛乳头周围的上皮性细胞阳性较多。毛乳头及真皮鞘中

12、阳性结果少见。    图2 未经培养的生长期游离毛囊的凋亡情况（略） Fig.2 The apoptotic status of uncultured hair follicle on anagen    a: fluorescence (10×10); b: DAB (10×10) 2.3 各部位凋亡细胞统计结果 见表1。 表1 各组生长期游离毛囊的凋亡指数（略） Table 1 The apoptotic index of hair follicle of anagen  

13、;  3 讨论 3.1 琼脂预包埋石蜡切片的优缺点 石蜡切片的制作步骤本身就繁多，又由于游离毛囊体积较小，容易丢失，而且定位困难，操作时容易被夹碎，这些缺陷给毛囊的形态学观察带来了一定的困难。因此，有学者采用琼脂预包埋法对毛囊进行处理3。采用琼脂预包埋实际上相当于扩大了组织的体积，并使组织定位成为可能，使操作更为方便。琼脂浸泡过的材料，凝胶呈薄层状均匀地包在组织块外周，并渗入到大的组织间隙中，对组织各部分之间起了一定的粘着作用；在脱水，透明过程中降低了乙醇和二甲苯对组织的收缩和硬化作用。因此，降低了易脆或易变碎材料的脆性。在实际操作过程中，通过我们多次摸索，推测15g/L的

14、琼脂浓度较目前较多采用的20g/L的浓度效果更佳。琼脂预包埋法还有一些缺陷尚待克服，如形成组织周围的轻度背景着色，包埋块不宜过小，温度不易控制等等，但对游离毛囊来讲无疑克服了操作过程中的很多不利因素，是石蜡包埋前可行的预包埋方法。 3.2 冰冻切片的优缺点 整个毛囊由20余种细胞所组成, 最中间为硬度较大的毛干，脆性较大，周围为软组织，在用石蜡切片法制作切片时，容易造成软硬组织之间的分离，如何获得完整的毛囊中心纵剖面一直是一个技术难点。经过多次操作实践，我们认为冰冻切片法的过程相对较为简单，制作步骤少，制作周期较石蜡切片短，不需要进行预包埋，能够克服石蜡切片制作过程中较多难点，但应注意在切片前

15、最好先用蔗糖溶液浸泡，以防止冰晶的产生，而且降温的速度宜快，使标本的温度与低温箱的温度相同(标本温度过热切片组织易被挤压，组织结构重叠；温度太低时，切片组织易脆裂)。本次实验我们采用了-29的低温，可以获得4m左右的切片，切片刀片要求锋利，太钝容易造成毛干与组织鞘分离；高速切削可能会取得良好结果，但对毛囊，仍需要低速，速度太快，切片厚度不均匀，还会造成真、表皮分离或毛干与组织鞘分离。操作中发现横切易使毛干与组织鞘分离；故应先将样品台上的OCT修出平台，放置毛囊时应注意使毛囊球部朝向刀口，这样才有利于获得纵剖面。这一方法简单易行，但对冰冻切片机要求较高。石蜡切片是较为传统的组织切片制作方法，由于

16、需要进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切块等许多环节的操作，所以标本在制作过程中的流失较为严重；在切片过程中，不能确定客观的平面, 主要凭借操作者的主观判断进行调整，获得完整的毛囊纵剖面相对较为困难，所以获得切片的总体效果不如冰冻切片。 3.3 凋亡检测方法的探讨 本次实验，我们主要采用原位荧光染色与DAB染色相结合的方法在原位探讨了毛囊的凋亡现象，发现了即使在生长期的毛囊中也存在着凋亡现象，由于毛囊中含有黑色素颗粒，DAB染色时阳性细胞显示棕色,故单纯用DAB结合复染观察时黑色素会对阳性细胞有一定的干扰，但结合荧光染色进行观察则可以最直观地对凋亡结果进行显示。通过反复实践我们还发现，琼脂预包埋

17、法应用于游离毛囊的石蜡切片，可扩大组织体积，使定位更为方便。石蜡切片法和冰冻切片法都可用于毛囊的组织观察，冰冻切片法由于步骤简单，对毛囊的形态影响较小，因此我们推测更适合凋亡的检测。 3.4 毛囊各部位细胞的凋亡 在实验中，我们观察到外根鞘由于存在围绕毛干的角化所发生的凋亡现象，所以即使在正常的游离毛囊中也存在一定的凋亡水平，而且是以毛干为中心向真皮鞘方向逐渐发生。Narisawa等4通过对人头皮毛囊的观察，发现在生长期毛囊外根鞘可呈现“口袋状结构”的凋亡现象。Soma等5通过对生长期游离毛囊的原位凋亡染色发现，内根鞘中存在大量的凋亡细胞，相邻的角化区域也呈阳性染色，毛乳头和真皮鞘则很少出现阳

18、性细胞。在退行期毛囊、外皮根鞘的外层、上皮条索、毛乳头周围的上皮源性细胞都可见阳性细胞, 而且发现TUNEL阳性细胞的增长是在从不发生终末改变的地方发生的。与我们的研究结果基本一致。所以我们初步推测正常毛囊的凋亡现象可分为两类，一类是围绕着角化这一现象发生的，毛囊中存在的较多的凋亡现象，即内根鞘、外根鞘内侧的类似于“袋状”结构的凋亡。另一种凋亡是与毛囊细胞的这种终末转变无关的个别细胞的凋亡。 我们的研究结果提示冰冻切片应用于游离毛囊简单有效，TUNEL原位荧光结合DAB染色适合于检测毛囊细胞的凋亡情况。 参考文献： 1杨壮群, 屠军波, 姚天华, 等. NGF与雌激素对离体培养的人头皮毛囊影响的实验研究 J. 中华整形外科杂志, 2004, 20(1): 4850. 2屠军波, 杨壮群, 姚天华, 等. 游离毛囊体外培养模型构建及形态学检查 J. 中国美容医学杂志, 2003,12(6): 565568. 3钟白玉, 伍津津, 刘荣卿, 等. 游离毛囊的常规病理制片技术 J. 中华皮肤科杂志, 1995, 28(4):250. 4Narisawa Y, Nashimoto K, K