生长激素受体的结构_功能及其信号途径

1、SM介导假说,该假说认为GH刺激肝细胞释放IGFs,再经IGFs作用于靶细胞促进细胞的增殖和生长。此外,还发现GH还能够刺激肌细胞分泌SM。直接作用假说,GH促进软骨代谢作用需经由SM介导,但促进骨骼延伸和生长的作用则不需要IGFs的参与,而是通过GH直接刺激骺软骨细胞的生长来实现的;GH对脂肪组织的促成熟分化作用,对免疫系统以及造血细胞的促增殖发育作用可能主要是通过后一种途径起作用的13,16,17。近年来的研究表明,GH的功能不仅仅局限于促进生长,其促生长以外的功效,特别是其在免疫系统中的作用已日益引起人们的注意。注:附表所涉及的序列分析在本所汤海旭博士的帮助下完成,特此致谢。参考文献01

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6、因子/促红细胞生成素受体超家族成员之一,其信号经由Jak2Stat路径介导。近年来发现GH和其受体可进入核内介导信号。本文从以下几个方面概述了目前GHR的结构、结构与功能的相互关系及其信号转导的研究进展:(1GHR的结构;(2促乳素/生长激素/细胞因子/促红细胞生成素受体超家族;(3GH结合蛋白;(4GHR的组织分布:(5GH及其受体的相互作用;(6GHR的信号传导途径;(7GHR的功能分析;(8GHR的结构功能分区;(9GH的核信号途径。关键词受体,促生长素;结构;功能;信号传导人生长激素受体(G rowth Hormone Recep2 tor,GHR是一个由单一基因编码含620个氨基酸的

7、跨膜糖蛋白,是促乳素/生长激素/细胞因子/促红细胞生成素(GH/PRL/Cytokine/Hemo2 topioetin受体超家族成员之一。这一家族的结构特点是受体胞外二百多个氨基酸具有较明显的同源性,并具有相似的信号路径。GHR介导GH的多功能效应不通过典型的第二信号(cAMP或IP3系统,其受体分子本身也不具备一般生长因子受体的内在Tyr蛋白激酶活性及有关蛋白激酶结构域。GH结合胞膜受体并诱导GHR分子同源二聚化为GH信号转导所必需,被二聚化激活的GHR结合并激活一种非受体型胞浆可溶性Tyr激酶Janus K inase2(JAK2;激活的JAK2使自身及GHR磷酸化,并同磷酸化的受体一起

8、将GH信号进一步向下游传递,其具体的信号途径随GH的剂量及靶细胞的差异而有所不同14。1GHR的结构已获得人、兔、小鼠、大鼠、羊、牛、猪、鸡、鸽子和猴共十个种属GHR cDNA克隆。人GHR 基因位于第五号染色体上,与促乳素(PRL受体基因毗邻;hGHR cDNA共编码638个氨基酸,其中包括18个氨基酸的信号肽(-180位。成熟的人GHR分子是一个含620个氨基酸的单链糖蛋白,其中N端246个氨基酸含5个潜在的糖基化位点,位于细胞外,构成激素结合结构域,第247270位为强疏水性氨基酸构成的跨膜区,C端350个氨基酸位于胞内构成信号转导结构域1,5。与INS,PDGF等生长因子受体不同的是其

9、胞内区不含内在Tyr蛋白激酶活性。基于cDNA推导的氨基酸序列,GH受体分子量应为70kD,但事实上共价交联技术所揭示的人IM29淋巴细胞表面GHR分子量为104kD,人肝细胞表面GHR的分子量为124kD,这种表观分子量上的差异是由N2糖基化和泛肽化引起的3,5。此外,de Vos6等揭示了GHR复合物晶体结构,这进一步促进了激素与受体的相互作用及其信号跨膜传导的研究工作。2GH/PRL/Cytokine受体家族GHR是GH/PRL/Cytokine/Hemotopioetin 受体超家族成员之一2,这一家族成员包括下列细胞因子受体,它们是:GH,PRL,EPO,MP L, LIF,G2CS

10、F,G M2CSF,I L27,9,11,CNTF,IFNs (,等。尽管这一家族成员全序列间的同源性较低,但其胞外区(约200个氨基酸具有较显著的同源性。这一家族受体具有四个特征1,2,7:大多数受体分子N端保守区内含有4个Cys形成二对二硫键;除GHR外,胞外同源区C端含有一个高度保守的WSXWS模块, GHR中为保守的YGZFS模块所取代;胞内无内在的Tyr激酶活性、无ATP结合结构域,但近膜区存在一个富含脯氨酸序列(72amino acid Proline2rich sequence。它们都可经由Jak2 Stat途径介导信号。3GHBP除GHR外,人们还发现在血液中以及大多数种属的组

11、织可溶性胞浆组分中存在一种可结合GH的蛋白,称之为生长激素结合蛋白(GHBP3。GHBP相当于GHR的胞外部分,其来源有二种;大鼠和小鼠的受体基因初级转录物经可变剪接产生二种mRNA,4.5Kb转录体编码GHR,1.2Kb编码GHBP;但对大多数种属只有单一mRNA转录体(4.5Kb可被North2 ern Blot探测到,在这些种属中,GHBP可能是通过对GHR特异性的蛋白酶酶解产生的2,8。最近Martini等9克隆到猴GHR并且研究了其GHBP的产生机制,它们的研究指出,当猴GHR cDNA在哺乳动物细胞中表达时,GHBP可经特异性的蛋白酶酶解产生;同时,他们利用3-RACE技术检测到编

12、码跨膜区和胞内区被9肽片段替代的GHR cDNA的存在,这种转录体存在于许多组织中;这表明上述两种机制在猴GHBP的产生中都发生作用。近年在人血液中发现两种GHBP:一是高亲和性、低结合容量的GHBP21,分子量为61kD,具有同GHR胞外部分相似的结构和生物免疫活性;另一分子为低亲和性、高结合容量的GHBP22,分子量为100kD,它同GHBP21和GHR无结构相关性并表现出对20kD2GH的高特异性。一般认为GHBP是一种GH活性调节剂(M odulator,调节自由GH(Active和结合GH(Inactive之间的比例,延长GH的生物半衰期;血清GH的生物半衰期大约为20分钟,但GH2

13、GHBP复合物却可稳定几个小时2,3。4GHR的组织分布来自免疫组化、原位杂交、结合分析等方法的证据表明,GHR普遍分布于生物体各种组织之中3,5,10。在大鼠胚胎发育过程中至出生前,所有组织GHR mRNA表达水平都较低,出生后,特别是肝、肾、心脏和肌肉的GHR mRNA 表达水平在短期内会明显提高;此外,怀孕期间mRNA表达也会增强3。5GH2GHR的相互作用GH/PRL/Cytokine受体超家族成员胞外部分(ECD共同的结构特点是含有二个特征性的桶形结构域。hGH与其受体ECD复合物晶体结构分析显示,GHR的ECD也具有这二个结构域6,每个结构域由7个片层构成;这些结构域的拓扑结构类似

14、于免疫球蛋白保守区,伴侣蛋白第二结构域,CD4的D2区,三型纤维连接蛋白的结构。来自X射线晶体衍射的实验证据进一步表明,一分子hGH可以诱导二分子GHBP二聚化,形成GH2(GHBP2复合物。hGH分子表面存在二个受体结合位点,分别被称为结合位点1(Site1和结合位点2(Site2;结合位点1包括Helix1中部部分残基,Helix4后2/3片段,3847位残基组成的短螺旋;结合位点2包括Helix3的部分和分子的N端。这二个结合位点结合GHR同一区域,Site1对受体的亲和性高于Site2。来自GH和PRL杂合分子以及GH分子突变实验表明GH2 (GHBP2复合物是通过一种有序方式形成的,

15、 Site1先结合一分子GHBP,再通过Site2结合第二个分子GHBP2,8,11。G enentech小组制备了一种嵌合受体,它包含hGH受体ECD和跨膜肽以及G2CSF的胞内区。含这种嵌合体的FDC2P1细胞转化株具有可检测的GH活性,人GH Site1内引起对受体亲和力下降的突变体刺激转化的FDC2P1细胞的增殖活性显著减弱;对受体结合亲和力增强的突变体刺激转化FDC2P1细胞(FDC2P12wt GHR的增殖活性显著增强。另一类在Site2内的突变如hGH (G120R具有完整的受体结合能力,但缺乏刺激增殖能力2,12。受体的同源二聚化对于GH发挥生物作用显得很重要。在结合位点2内的

16、突变可导致GH不能结合第二个分子的GHBP,这种类似物也不具有生物活力;Takahashi等13发现一个身材矮小的女孩,其体内GH发生单位点突变,进一步分析表明,这种发生在Site2内的突变体GH(D112G趋向于形成1:1而不是1:2GH2 GHBP复合物,由其引起GHR,Jak22和Stat25的磷酸化作用明显低于天然GH。适当浓度的二价抗体可以模拟GH全部可测的功能活性,而单价Fab片段不具有这样的活性,但继续补加二抗又可以得到类似二价抗体的效应。GH2 (GHBP2复合物的形成对GH和GHBP的浓度变化表现出钟罩形曲线;低浓度hGH刺激活性的产生,高浓度hGH表现出明显的活性抑制效应,

17、rPRL也有类似的现象。许多实验证据表明配体诱导受体的同源二聚化可能是GH/PRL/ Cytokine受体家族发挥功能的第一步2,8,11。GH与受体的结合依赖于二价阳离子的存在。在最适Ca2+浓度的下,hGH与受体的结合亲和力是无Ca2+时的十九倍,这种结合活性对钙离子浓度的强依赖性归因于Helix1C端3034位氨基酸残基;晶体结构显示hGH的E30,E34,D170和第一个结合的GHR E220, E127在空间上相邻;类似物p GH(K30E, R34E对受体的亲和力约为wt2p GH的3倍,这一现象进一步证明了钙离子的重要性11,14。大多数种属包括硬骨鱼GHR都能够结合hGH,但是

18、hGHR只能结合灵长类GH。hGHR 第43位Arg可能与这种种属特异性有关,非灵长类GHR第43位为Leu。用牛GHR(L43R、大鼠GHBP(L43R以及相应的野生型cDNA 转化大鼠L细胞,野生的和突变的bGHR对hGH的亲和力相似,而突变的bGHR对bGH 的亲和力下降200倍;野生的和突变的GHBP 对hGH具有同等的亲和力,但只有野生的GHBP能结合bGH;125I2hGH对野生的和突变的GHR共价交联(Cross2linking Studies产生141kD标记复合物,bGH只能阻断125I2hGH对野生受体的交联;hGH和bGH都可刺激转化细胞内95kD蛋白的磷酸化,但对转化突

19、变GHR 的细胞,bGH刺激作用减弱13。不同种属来源的GH序列差异较大,GH生物效应的种属特异性可能不只是受体的差异产生的。GH/PRL/Cytokine受体家族ECD部分多数含有WSXWS模块,WSXWS序列内的突变将会干扰配体的结合和受体的信号转导。Baumgartner等16将GHR的等价序列YGEFS中氨基酸分别用Ala替代,发现只有Y222A, G223A,S226A表现出弱配体结合亲和力和低信号转导活力;利用构象特异的单抗显示Y222A,S226A受体的构象发生了变化,晶体结构显示Tyr222和Ser226位于第二个桶结构域,在与配体作用过程中充当重要角色。6GHR的信号转导途径

20、GH与细胞膜上受体结合将刺激受体本身以及多种细胞内蛋白的Tyr残基的磷酸化。Ar2 getsinger15等发现胞浆非受体Tyr激酶Jak2与GHR偶联,并可被GH激活。Jak2是Janus K i2 nase(也被称为just another kinase家族成员之一,这一家族包括Jak1,Jak2,Jak3及Tyk218。值的一提的是,GH/PRL/Cytokine受体家族胞内部分无任何序列同源性,它们却分享一个共同的信号途径,即配体结合胞膜受体诱导二聚化,激活胞内Jak2,并由后者进一步将信号向下游传递2,7,18。Jak激酶的激活伴随着多种胞内蛋白的磷酸化,特别是Tyr的磷酸化,已被鉴

21、定的有IS2 GF3组分91/84kD(Jak2stat Pathway,ERK1和ERK2(MAP激酶途径,S6激酶家族成员(S6激酶途径1,4。此外,来自大鼠脂肪细胞的研究显示,DAG/PK C参与了GH的胰岛素样效应途径,如葡萄糖吸收和促脂生成作用;G2蛋白,磷酸脂酶C参与了GH的胰岛素抗性效应以及脂降解作用,在以上提及的这些途径中,GH可能有赖于靶细胞自身的特异性有选择地利用其中一种或多种信号途径。总之自人和兔GHR被克隆和Jak2作为GHR信号分子被鉴定以来,人们已经积累了许多与GHR信号转导有关的重要数据,但对GHR转导GH多功能生物效应途径的细节仍然知之甚少1,2,4。7GHR的

22、功能分析早期用于测定GH活力的方法主要有生物测定(即刺激个体生长、放免(RIA、放射受体分析法(RRA,以及促葡萄糖吸收等方法。近年来GHR cDNA和GH应答基因共转染细胞,已被广泛应用于建立GH,GHR的功能分析系统。GH可以诱导一些不依赖于IGF2I的基因表达,它们包括Spi 2.1,C2fos,脂蛋白脂酶,生长激素抑制素(S omatostatin,胰岛素以及细胞色素P45011C1311等。目前已利用这些被调控基因的启动子构建了多种用于共转染的融合基因,如2Lactoglobulin/CAT,Spi2.1/CAT, C2fos/Luciferase等2,此外,GH促进RIN5AH 或

23、转化了GHR的RIN5AH细胞的INS表达效应,以及GH促进转化了GHR的CHO细胞的MAP激酶活化和蛋白质合成效应,也常被用来作GHR功能分析系统。8GHR功能结构分区(突变分析不同亚型的GHR以及受体胞内不同区域应答不同的GH效应。许多研究清楚地显示了GHR受体胞内区COOH端为刺激转录和蛋白质合成信号的转导所必需,胞内近膜区参与了受体介导的GH分子内部化过程,特别是近膜的富含脯氨酸区更为GH各种功能效应的发挥所必需。为鉴定受体胞内区的功能结构域,一系列GHR突变体被制备并被用于分析这些突变体转化细胞后的功能状况。8.1GH激活Jak2的结构基础GH结合细胞表面GHR,诱发GHR二聚化,引

24、起胞内Jak2以及包括受体自身在内的一系列蛋白质的磷酸化,并且GH信号的GHR下游早期事件总是表现为Jak2的磷酸化与激活。Frank等19分别使用CHO系统发现截短的只含胞内5个氨基酸的GHR(12275(采用620个氨基酸序列计数体系失去了激活Jak2的活性,截短的GHR(12542,GHR(12390,GHR(12317,缺失形式的GHR(d2972406均保留了GH依赖的Jak2激活活性,而如果将GHR(d2972406和GHR(12620的第2872292位富含脯氨酸的box 1区域缺失或将该区4个脯氨酸突变为丙氨酸,都将会失去这些活性。S otirpoulos等20的结果进一步显示

25、胞内只含近膜46个氨基酸的GHR足已激活Jak2和诱发MAP激酶途径;表明胞内近膜区的46个氨基酸特别是富含脯氨酸区为Jak2激活所必需。I L23依赖的FDC2P1和Pro2B细胞在转化GHR后,可以在无I L23有GH存在下正常生长,只保留胞内54个氨基酸的突变体即可维持这二种细胞的生长以及Jak2的激活21;其中任何二个Pro或一个Lys发生突变都会使Pro2B细胞为GH刺激的增殖活性丧失。这些实验结果为验证细胞增殖需要Jak2 Stat途径参与的假说提供了佐证。8.2参与调控基因表达的GHR结构域RIN25AH细胞可被GH诱导产生胰岛素,转化GHR后可以增强GH依赖的胰岛素表达;被GH

26、R(12194或GHR(12454(引文采用638个氨基酸序列计数体系转化的RIN25AH细胞在GH诱导下,不再产生胰岛素。K elly等利用GHR基因和Spi2.1/CAT融合基因共转染的实验也证实了上述结果22;此外富含脯氨酸区的缺失或被突变为丙氨酸的GHR突变体都不能介导GH促转录活性。Thomas等23还发现Spi 2.1基因的表达可以为抗P2Tyr单抗抑制,但不能被抗Stat1、Stat3或Stat4多抗阻断,并且S outhwestern印迹分析表明Spi2.1DNA探针可探测到41kD和35kD两个被GH诱导磷酸化的蛋白出现在核抽提物中,表明GH刺激的Spi2.1或INS基因的表

27、达是经由一条不需要Jak-stat的途径起作用的。8.3参与代谢调控途径的GHR结构域在转化了大鼠GHR的CHO细胞中,GH能够刺激蛋白质的生物合成和脂质代谢,类似的代谢效应也在其他表达内源GHR的细胞类型中观察到。转化了GHR(12454的CHO细胞具有GH的蛋白质合成和脂降解效应,而表达只含胞内5个氨基酸的GHR(12294会失去这一活性,说明第294454位残基在诱导代谢效应中充当了重要的角色;其中299306位富含脯氨酸区的缺失或将Pro突变成Ala均会导致这一性质的丧失22。值得提及的是,在观察到表达GHR(12454的CHO细胞代谢效应的同时,总能检测到MAP激酶活性,而在表达GH

28、R(12 294或富含脯氨酸区发生缺失或Ala替代的两种突变体的CHO中,测不到MAP激酶活性,推测MAP激酶的激活可能是GH代谢途径诱发的中间途径。8.4参与内部化的区域GHR在结合GH 后会迅速发生内部化。Allevato等24利用CHO 和COS27两种表达系统分析了rGHR内部化现象,来自这二个系统的结果一致,GHR内部化机制无种属特异性;突变体rGHR(12381与wt2 GHR(12638表现出同样程度的内部化,而rGHR(12294和rGHR(12318都不具有内部化现象,表明受体的内部化依赖于318381片段。芳香族氨基酸对一些激素受体的内部化往往发挥重要作用;rGHR(126

29、38Y333F Y338F能正常发生内部化,rGHR(12638F346A不能发生配体介导的受体内部化作用,但不影响GH 刺激的共转染的Spi 2.1启动子的转录活性。表明第346位Phe为GHR内部化所必需24,但不参与GH诱导的基因表达作用,同时表明配体介导的受体细胞内吞作用不是GH发挥促基因转录作用的前提条件。8.5受体Tyr磷酸化作用的重要性配体的结合和GHR的二聚化导致胞内激酶Jak2、受体本身、Stat分子以及MAPK组分的Tyr磷酸化。有证据表明GHR的磷酸化并不是细胞增殖信号和Jak2Stat激活所必需的;激活的Jak2可以磷酸化GHR(12638和GHR(12454的Tyr3

30、33和Tyr338,但Y333F和/或Y338F突变并不改变GH依赖的Jak2与GHR结合以及Jak2的磷酸化22,不过这些证据还不足以说明Tyr残基在GHR信号途径中的功能。Lobie 等25发现CHO2GHR(12638Y333F Y338F具有正常的配体结合、配体介导的受体内部化以及GH刺激的Spi2.1/CAT转录活性,但不具有CHO2GHR(12638类似的代谢调节功能,如促脂肪形成、蛋白质合成等,说明GHR特定的Tyr磷酸化与细胞选择性功能效应的应答有关。9GH的核信号途径甾体激素、甲状腺素等脂溶性激素是经由胞内受体介导生物活性的。多肽激素普遍被认为是经由细胞表面的受体将其生物信号

31、传入胞内。然而近年来人们越来越多地发现一些多肽激素和生长因子具有核转位现象,并且在核内发现有相应的受体或结合蛋白存在24;这些多肽激素主要包括GH,PRL,INS,NGF,EGF,14 Foreign Medical Sciences Section of Pathophysiology and Clinical Medicine 1999 ,19 (1 5 : 154 - 158 02 Kelly PA , G oujon L , Sotiropoulos A et al . Horm Res , 1994 ; 42 : 133 - 139 03 Strobl J S , Thomas MJ

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