食-品-检-验-技-术(微生物部分)

1、食 品 检 验 技 术 -微 生 物 部 分一、食品中的微生物及其检验（一）、食品中细菌总数检验的意义1、细菌总数：通常指1g或1mL或1cm²表面积食品检样，经过技术处理，在一定条件下做细菌培养后，所得的细菌菌落总数。eg：肉类沙门氏菌；海产品副溶血性弧菌；冰箱食物嗜冷菌2、食品微生物检验的意义 1）、是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据； 2）、可以判断食品加工环境的卫生情况，为食品安全监管提供科学依据，可以有效的防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生； 3）、保证产品的质量，避免不必要的损失。（二）、食品中大肠菌群检验的意义1、大肠菌群：是指一群好氧与

2、兼性厌氧，能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌（37）2、食品中常见的微生物指标 菌落总数、大肠菌群、霉菌及其毒素、致病菌、其他指标3、食品微生物检验范围 1）、生产环境的检验； 2)、原辅料的检验； 3）、食品加工、储藏、销售储环节的检验； 4）、食品检验。（三）、灭菌消毒的几种方法1、湿热杀菌（高压蒸汽杀菌）eg：培养基、吸量管、工作服2、干热杀菌（高温干燥灭菌）eg：工作服、口罩3、75%酒精、消毒水 4、火焰杀菌 5、紫外灯二、培养基（一）、培养基所需的基准物质1、营养物质（氮源、碳源、无机盐、生长因子、水）；2、水； 3、凝固剂； 4、抑制剂； 5、指示剂孟加拉红测酵母菌、霉菌大

3、肠杆菌：乳糖胆盐；抑制剂是胆盐类（二）、培养基的分类1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基2、根据培养基的物理状态来区分，可以分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基3、根据培养基的用途来区分，可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基（三）、注意事项1、一般培养法：需氧培养2、培养温度：25 373、培养基：指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足够的水分；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用4、灭菌后pH值会下降0.1 0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1 0.25、基础培养基保存不能超过两周；生化试验培养基

4、不宜超过一周。（四）、微生物培养特性观察与记录1、在固体培养基上：观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状边缘特征及迁移性等。2、在液体培养中：表面生长情况，浑浊度及沉淀等。3、半固体培养基穿刺接种：观察运动扩散情况。三、染色与细菌的形态观察技术（一）、影响染色的主要因素1、操作因素：涂片、固定、脱色2、染液因素：新鲜3、细菌因素：不同生长期有所改变（二）、几种常用的细菌染色法1、简单染色法又叫普通染色法，只能用单一染料进行的染色简单染色法的基本程序：涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检单染色：形态观察，但不能鉴别复染色：两种或两种以上染料2、革兰氏染色法革兰氏染色原理：细

5、菌先经过碱性染料染色，用脱色剂脱色，再复染，若菌体仍保持原来的染料的颜色，就称为阳性；若菌体被脱色，染上复染料的颜色，就称为阴性。（紫色阳性，红色阴性）染色流程：涂片 干燥 固定 初染 水洗 媒染 水洗 脱色 水洗 复染 水洗 干燥 观察1）、制片：取菌一定不要太多，涂片不要太厚，均要无菌操作2）、初染：用草酸铵结晶紫染色1min后水洗3）、媒染：滴加碘液媒染1min后水洗4）、脱色：滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约20 30s即可水洗5）、复染：用番红染液复染约1.5min后水洗6）、干燥：用吸水纸吸掉水滴，于室温下自然干燥7）、镜检：注意细胞的颜色并绘出细菌形态图。所需试

6、剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红染液、石炭酸复红染液注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染液做复染液，复染时仅需10s3、芽孢染色法 芽孢着色、脱色都很难，需采用强染色剂加热染色 染色流程：制片 染色 水洗 复染 镜检 实验结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色 染色试剂：孔雀绿染色、番红水溶液4、荚膜染色法 原理：荚膜是包围在细菌细胞外面的一层黏液性物质，经过染色、脱色后将菌体和荚膜呈现不同颜色。 染色流程：制片 固定 染色 镜检 染色试剂：纯甲醇、番红液或沙黄染色 实验结果：番红：荚膜无色，细胞红色； 沙黄染色：荚膜呈黄色，炭疽芽孢性杆菌呈赤褐色四、食品卫生细菌学检验技术（一）、检验前的准备

7、1、杀菌：各种玻璃仪器、各种试剂、各类培养基、工作衣、鞋、帽等，灭菌冷却后送无菌室备用。2、做好无菌室或超净工作台的无菌工作，进入后实验没有完成之前不得出入无菌室。（二）、采样的原则1、代表性； 2、无菌性； 3、完整性； 4、清楚性； 5、真实性； 6、严格性；涂抹用100mL的生理盐水；平时样品用225mL的生理盐水。注：若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部提取。（微生物检验不进行复检）（三）、菌落总数：是指在被检样品的单位质量（g），容积（mL）或表面积（cm²）内，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。（单位：CFU）注：一定条件下是指培

8、养基及其pH、培养温度与时间、计数方法 （每个稀释度两块平板） 37 、48h（四）、菌落计数与稀释度的选择及菌落数的报告1、菌落计数若片状菌落不到平皿的1/2，而其余1/2中菌落分布又很均匀，则可计算1/2个平皿后乘以2以代表全平皿菌落数。若仅一条链，则视为一个菌落；若有不同来源的几条链，则视为每一条链为一个菌落。2、稀释度的选择 1）、应选取平均菌落数在30 300之间的稀释度报告（见表56中例1）。 2）、若有2个稀释度均在30 300之间时，若比值小于或等于2时，取其平均数；若比值大于2时，取其较小数字（见表56中例2和例3）。 3）、若所有稀释度均大于300，则取最高稀释度的平均菌落

9、数乘以稀释倍数（见表56中例4）。 4）、若所有稀释度均小于30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数（见表56中例5）。 5）、若所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数（见表56中例6）。 6）、若所有稀释度均不在30 300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表56中例7）。3、菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数来表示。表56 稀释度的选择及菌落数的报告方式例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数/（个/g或mL）报告方

10、式/（个/g或mL）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.6×102多不可计295461.63775038000或3.8×103多不可计271602.22710027000或2.7×104多不可计560313-313000310000或3.1×105527115-270270或2.7×1026000-1×10107多不可计305123050031000或3.1×10（五）、食品卫生大肠菌群检验技术1、大肠菌群：是指一群在37培养24h能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

11、（单位：MPN）2、大肠菌群的生物学特性1）、形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽孢杆菌2）、发酵乳糖产酸产气3）、培养特性： 在EMB琼脂上的典型菌落：呈深紫黑色或中心深紫色，圆形稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常带有金属光泽。 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红圆形，扁平，光滑湿润。（六）、菌落总数与大肠菌群检测方法的比较项 目检测步骤培养基培养条件单位菌落总数检样稀释倒平皿培养计算报告营养琼脂生理盐水37、48hCFU大肠菌群检样稀释初发酵分离证实试验（染色和复发酵）计算报告乳糖胆盐生理盐水37、24hMPN（七）、检验注意事项1、从制备样品原液至稀释完毕，全过程不得超过15min。2

12、、对产酸，但未看到气泡的乳糖发酵，考虑气泡产生。3、进行证实试验，最少挑2个以上的典型菌落或非典型菌落。五、食品中常见病原微生物检验技术（一）、沙门氏菌检验技术1、沙门氏菌：为革兰氏阴性短杆菌，不产芽孢及荚膜，周生鞭毛，能运动，兼性厌氧。2、检验程序：检样 增菌（BP增菌液） 分离培养（BS选择培养基或DHL选择培养基） 生化试验初步鉴定 血清学试验（鉴别沙门氏菌种类） 报告 3、生物学特性 1）、营养特性：需氧或兼性厌氧，最适温度37，pH6.87.8 对营养要求高。在普通培养基上生长良好，37，24h，能形成菌落中等大小，直径23mm，圆形或卵形，表面光滑湿润。 2）、抗热性差，在60经2

13、030min就可被杀死。4、沙门氏菌检验目前通用的方法分五个步骤： 1）、前增菌； 2）、选择性增菌； 3）、选择性平板分离； 4）、生物化学筛选； 5）、血清学鉴定（二）、金黄色葡萄球菌检验技术1、生物学特性 1）、无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏阳性菌 2）、培养特性：营养要求高，在普通培养基上生长良好； 需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH7.4； 有高度的耐盐性，可在10%15%NaCl肉汤中生长。 3）、生化特性：可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸产气2、 操作要点 1）、增菌：7.5%NaCl肉汤；37，24h，呈均匀浑浊生长。 2）、平板分离：血平板，37，244

14、8h3、 检验程序 检样 稀释 增菌培养（7.5%NaCl肉汤增菌培养） 分离实验（血平板、BP分离） 镜检、血浆凝固酶试验 报告结果注：血浆凝固酶试验是生化试验的一种，也是证实试验的一种。 血浆凝固酶试验：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。4、 检验结果菌落呈金黄色，大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（B型）。在BP平板上的菌落特征：圆形，光滑凸起，湿润，直径2 3mm，呈灰色至黑色，边缘色淡，周围为浑浊带，在其外层有一透明带。5、金黄色葡萄球菌污染的控制 1）、防止带菌人群对各种食物的污染； 2）、防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染； 3）、对肉制品加工厂； 4）、防

15、止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成。（三）、溶血性链球菌的检验1、生物学特性 1）、形态学与染色：呈球形或卵圆形，直径0.5m 1m链状排列。 革兰氏阳性；衰老培养物常呈阴性。 无芽孢、无鞭毛、多数无荚膜。 2）、培养特性：多数为需氧或兼性厌氧，少数为微需氧或专性厌氧； 对营养要求高，普通培养基不能良好生长； 最适温度37，pH7.47.6； 在液体培养基中，溶血菌株，呈絮状或颗粒状沉淀生长（上清下浊），不溶血菌株，均匀浑浊生长； 在血平板上，形成灰白色，半透明，表面光滑，有乳光，圆形突起的细小菌落，菌落周围出现溶血环。 3）、生化特性：均分解葡萄糖产酸； 可分解蕈糖，不分解山梨醇、菊糖。 4）、抵

16、抗力：60，30min即被杀死，对常用消毒剂敏感。2、检验程序液（固）体检样 样品处理 增菌培养葡萄糖肉浸液肉汤（或区克氏肉汤：在污染严重时使用）36，24h 分离培养（血平板、37，24h；菌落灰白色） 分纯培养（血平板、37，24h；菌落灰白色） 生化鉴定（溶血素） 报告注：镜检：革兰氏阳性，符合者可做生化鉴定（四）、志贺氏菌检验技术（志贺氏菌又称痢疾杆菌）1、生物学特性 1）、形态与染色：为革兰氏阴性杆菌，不形成芽孢，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。 2）、培养特性：需氧或兼性厌氧。对营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.47.8。在普通培养基上和SS平板上菌落呈圆形

17、、微凸、光滑湿润、无色半透明，边缘整齐；宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落；在肉汤中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 3）、生化反应：能分解葡萄糖，产酸不产气，均不发酵乳糖，除宋氏志贺菌外，且均不产H2S。2、 检验程序检样 样品处理 增菌培养（GN增菌液） SS、EMB平板分离培养（无色、透明、不发酵乳糖的菌落） 初步生化鉴定 最后血清学鉴定 报告3、 志贺氏菌在TSI生长的结果 斜面产碱仍为红色或粉红色； 不产H2S，不出现黑色； 底层产酸不产气，呈黄色。注：在常温中生存时间短，应尽快进行试验。（五）、食用霉菌、酵母菌的检验1、检验程序 检样 处理 稀释 平板分离培养 菌

18、落计数 报告2、 操作要点 谷物类是霉菌、酵母菌最喜欢的食物； 培养基：孟加拉红或虎红 霉菌2528的温箱中，三天后开始观察，计数时以第五天为准。（六）、副溶血性弧菌的检验1、生物学特性 1）、形态与染色：革兰氏阴性无芽孢多形态杆菌，单端鞭毛，两端浓染。 2）、培养特性：需氧或兼性厌氧，生长最好； 在2%3%NaCl培养基中生长最好，无盐或食盐11%时不能生长。 最适温度37，pH7.78.0； 在专用选择性平板上，菌落呈圆形凸起，浑浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐； 血平板：可见溶血环。 3）、生化特性：分解葡萄糖产酸不产气；分解甘露醇，不分解乳糖、蔗糖。2、 检验程序采样 样品处理

19、增菌培养（NaCl结晶紫增菌液）37，816h 分离培养 3.5%NaClTSI培养基（37，24h） 嗜盐性试验（37，24h） 生化鉴定 动物试验 结果报告注：分离培养：NaCl蔗糖平板：圆形、半透明或不透明，无粘性（绿）兰色，直径24mm。 嗜盐选择性平板：直径2.5mm，圆整或不齐，隆起混浊，无粘性，无色，湿润。 SS平板：直径2mm，圆形，隆起混浊，无粘性，湿润，暗绿色溶血环。 3.5%NaClTSI：培养37，24h，底层变黄，上层不变，不产H2S，有动力。 镜检：革兰氏阴性；无芽孢多形态，两端浓染。（蜡样芽孢杆菌中毒菌量：106108CFU；105CFU时，为危险食品）六、三糖铁

20、琼脂试验（TSI）1、 原理 1）、分解乳糖和蔗糖产酸产气，变黄。 （大肠杆菌） 2）、只利用葡萄糖，斜面红色，下端黄色。 （志贺氏菌） 3）、产H2S，变黑。 （沙门氏菌）注：大肠杆菌能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产H2S。 志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多数不发酵乳糖，不产H2S。 沙门氏菌能分解葡萄糖产酸产气，不发酵乳糖，大多数产H2S。2、 试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，36±1，1824h。七、设计方案测 豆 奶 10mL 1mL 1mL 1mL 1mL菌落总数：30000CFU 豆奶大肠菌群：30MPN 豆 奶 225mL 9mL 9mL 10º（原