腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗增强机体免疫功能的实验研究

1、    腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗增强机体免疫功能的实验研究        摘要：目的研究腺病毒介导的人GM-CSF基因转染瘤苗体内抗肿瘤 免疫作用极其机理。方法应用GM-CSF基因转染、辐照的瘤苗对 小鼠肝癌模型进行免疫基因治疗，观察该疗法对荷瘤小鼠脾细胞NK、LAK、CTL活性的影响、 脾淋巴细胞转化反应的影响以及荷瘤小鼠的生存期。结果经GM-CSF基因 转染瘤苗治疗后，脾细胞CTL活性显著升高，而NK、LAK细胞活性未见明显增强、脾淋巴细胞 转化反应显著增强

2、、生存期显著延长。结论GM-CSF基因转染瘤苗能诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，揭示了应用该疗法进行肿瘤 基因治疗的可行性。关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；腺病毒；疫苗；基因疗法中分类号：R730.3文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)04- 0266-03 AUGMENT OF ANTO-TUMOR IMMUNITY IN VIVO WITH ADENOVIRUS-MEDIATED HUMAN GM-CSF GENE THERAPYLIU Qing-hong(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical

3、College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)QIAN Hai-xin(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)GAN Jian-he,et al.(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225

4、001,China)Abstract：Objective To study the antitumor effect of cancer vaccine transfected with human GM-CSF gene in vivo and its mechanism. Methods The NK, LAK, CTL act ivity and the lymphocyte transformation test (LTT) of splenocytes from tumor-be aring mice after treated with GM-CSF-transfected and

5、 irradiated cancer cells w ere measured. The survival time was also observed. ResultsTreated with GM-CSF-transfected and irradiated cancer cells not only significantly augmented LTT and CTL activity (but not NK or LAK activity) of splenocytes, and also significantly prolonged the survival time of tu

6、mor-bearing mice. ConclusionIrradiated an d GM-CSF-transfected tumor cells induced effective anti-tumor immunity. The e xpression of GM-CSF gene in tumor cells seems to be feasible for cancer gene th erapy.Key words：GM-CSF;Adenovirus;Vaccines;Gene therapy重组腺病毒载体能成功地介导GM-CSF基因转染H22细胞并能有效表达、GM-CSF基因 转

7、染瘤苗体内致瘤性显著降低1。本文进一步研究该疗法体内应用后对荷瘤小鼠 免疫功能的影响，以期为该疗法应用于临床肿瘤治疗提供理论依据。材料与方法1、主要试剂携带人GM-CSF基因的重组腺病毒载体(Ad5亚型)以及未携带人GM-CSF基因 的假腺病毒颗粒由美国贝勒医学院黄汉贤博士研制并提供。3H-TDR购于上海原子能 研究所。基因重组人IL-2购于上海生物化学研究所。PHA购于广州医学工业研究所。RPMI- 1640购自日本制药株式会社。胰酶及DNA酶为Difco公司产品。2、动物及细胞株BALB/c近交系小鼠，雄性，68周龄，1618 g，购自中科院上海实验 动物中心。小鼠肝癌细胞株(H22)购自

8、中科院上海药物研究所。K562、P81 5细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。3、GM-CSF基因转染瘤苗的获得参照文献1，命名为H22-GM。同法 获得未携带人GM-CSF基因的假腺病毒颗粒的肝癌细胞，命名为H22-GM。4、瘤苗的辐照处理见参考文献1。5、小鼠脾淋巴细胞悬液的制备参照文献2，用RPMI-1640配成2×106/ml， 等用。6、小鼠脾细胞LAK、CTL活性的诱导取脾淋巴细胞悬液置于含10 % FCS的培养液中，加入r IL-2至终浓度为1000 /ml，培养3天，检测LAK活性。将脾淋巴细胞悬液与辐照灭活的H 22细胞以201比例置于含10 % FCS的培养液中

9、，置于5 % CO2、37温箱中温育6 天后检测CTL杀伤活性。7、NK、LAK、CTL活性的检测均采用3H-TDR掺入法。检测NK选用K562为靶细 胞，检测LAK时选用P815为靶细胞，检测CTL时选用野生型H22为靶细胞。用 计数仪测定cpm值。8、小鼠脾淋巴细胞转化实验采用3H-TDR掺入法。用计数仪测定cpm值，结果以 刺激指数(SI)表示：9、荷瘤小鼠的制备及治疗观察取体内传代H22肝癌细胞第57天的BALB/c小鼠，抽 取癌性腹水，用Hanks液洗2遍，配成1×106/ml，给BALB/c小鼠皮下接种0.1 ml，当皮下 长 出肿瘤结节达2 mm时随机分为4组，每组10

10、只，进行体内实验，下述治疗每周1次，连续2周 ， 其中5只用于免疫学指标的检测，于荷瘤后第15天处死小鼠送检，5只用于观察生存期。分组 如下：A组：对照组，腹腔内注射Hanks液0.1 ml/次，每天3次，连续3天；B组：H22 瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml用野生型H22细胞制成的瘤苗0.1 ml。C组：H 22-GM瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml H22-GM瘤苗0.1 ml。 D组：H22-GM瘤苗治疗组，腹腔内注射1×108/ml H22-GM瘤苗0. 1 ml。10、统计学分析采用两样本均数比较的t检验、方差齐性检验。结果1、对荷瘤小鼠脾

11、细胞NK、LAK、CTL活性的影响H22-GM瘤苗应用后对荷瘤小鼠 脾细 胞NK、LAK活性影响不大，各组间无显著差异(P0.05)，对于CTL活性的影响比较明显 。B、C组与对照组间差异不明显(P0.05)，而D组与对照组间存在显著差异(P0 .005)。表明H22-GM瘤苗应用后使CTL活性显著升高(见表1)。表1荷瘤小鼠经不同治疗脾细胞NK、LAK、CTL杀伤活性分组(n=5)杀伤活性(%)(±s)NKLAKCTLA(Hanks)18.68±2.6816.76±3.0726.09±3.08B(野生型H22)20.64±3.4217.92&

12、#177;3.7128.10±3.00C(H22-GM)16.94±1.4517.62±3.9726.76±2.77D(H22-GM)14.65±2.3315.88±3.5246.54±5.51*注：与Hanks对照组相比*P0.005 2、对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响不同治疗对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响不 同，与Hanks液对照组相比，野生型H22瘤苗和H22-GM瘤苗对荷瘤小鼠脾 淋巴 细胞转化反应无明显增强作用(P0.05)，而H22-GM瘤苗应用后则可使脾 淋巴 细胞转化反应显著升高(P0.01)，提示H22

13、-GM瘤苗应用后，机体细胞免 疫功能有所增强(见表2)。表2不同治疗对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响分组(n=5)淋巴细胞转化反应(%)(±s)A(Hanks)35.87±5.02B(野生型H22)37.20±6.33C(H22-GM)37.43±4.35D(H22-GM)63.46±9.52*注：与Hanks对照组相比*P0.01 3、对荷瘤小鼠存活期的影响本实验以皮下接种H22肝癌细胞为荷瘤模型，观察了各 种不同治疗对荷瘤小鼠存活期的影响，结果：A组(Hanks)：23.0±2.25；B组(野生型H 22)：26.6±

14、2.25；C组(H22-GM)：24.8±2.71；D组(H22-GM )：52.2±6.61，统计学处理：B、C组与对照组相比无显著差异(P0.05)，而D组 与对照组差异非常显著(P0.005)。以上说明：H22-GM瘤苗体内应用后发 挥了一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长。讨论细胞因子基因疗法是目前肿瘤基因治疗研究中的热门课题。人们设法将具有免疫调节作用和 抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使其体内持续存在一定 水平的内源性细胞因子，已取了初步疗效，它比直接注射细胞因子治疗的毒副作用轻、疗效 佳。GM-CSF作为一种具有多种潜能的造血

15、生长因子，目前正被用于恶性肿瘤的临床和实验研究 。Dranoff3等实验证实：分泌GM-CSF的黑色素瘤细胞在体内激发的强烈、长期 、特异的抗肿瘤免疫效应需CD4、CD8 T细胞参与。Armstrong4将分 泌GM-CSF的黑素瘤细胞接种小鼠皮下，局部组织切片示大量的CD4、CD8T细胞 的浸润。章卫平等5应用GM-CSF基因工程瘤苗免疫治疗小鼠，免疫功能检测发现 脾脏CTL活性显著升高。作者在以前的研究中证实：GM-CSF基因转染瘤苗体内致瘤性降低 、瘤苗的辐照处理抑制了肿瘤细胞的增生，但并不影响细胞因子的表达1，在此 基础上进一步研究了其对机体免疫功能的影响。本实验观察到：GM-CSF基

16、因转染H22 细胞在体内对于NK、LAK细胞活性的影响与对照组相比无显著差异，说明该疗法对机体NK、L AK细胞活性没有增强作用，而与对照组相比CTL杀伤活性明显升高，这可能是GM-CSF基因 转染瘤苗应用后发挥了一定抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长的最主要原因。由于野 生型H22瘤苗和H22-GM瘤苗组CTL杀伤活性未见明显升高，因此CTL杀伤活 性 升高与GM-CSF基因导入及表达分泌有关。而脾淋巴细胞转化反应显著升高则进一步表明， 该疗法使机体细胞免疫功能明显增强。研究表明，GM-CSF基因转染瘤苗体内接种后，局部持续存在的GM-CSF，一方面通过一 系列机制使其致瘤性降低、免疫原性

17、增强，为激活免疫功能打下基础；另一方面，则招引多 种免疫效应细胞(主要是CTL细胞)大量浸润，并激活其功能，对肿瘤细胞进行排斥和杀伤。 GM-CSF基因转染瘤苗这一抗肿瘤机制的发现，为进一步深入研究奠定了基础，也为最终 将其运用于临床治疗恶性肿瘤提供了理论和实验依据。(本文编辑：戴峰)作者简介：刘庆宏，男，硕士，主治医师。作者单位：刘庆宏（扬州大学医学院附属苏北医院肿瘤外科 扬州 225001）钱海鑫（苏州医学院附属第一医院）甘健和（苏州医学院附属第一医院）许期年（苏州医学院附属第一医院）陈易人（苏州医学院附属第一医院）参考文献1钱海鑫，刘庆宏，甘建和，等. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因

18、转染 瘤苗的抗肿瘤研究J. 中华实验外科杂志，1998，15(2)：1412Awwar M, North KJ. Cyclophosphamide-induced immunologically mediated of a cyclosphamide-resistent murine tumor: A consequence of eliminating precursor L 3T4 suppressor T-sellsJ. Res, 1989, 49:16493Dranoff G, Jaffee F, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor ce lls engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating fac tor stimulate potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunityJ. Pro c Natl Acad Sci USA, 19