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文档简介
1、尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型脑组织形态学的影响研究钟振东【作者简介】钟振东(1974-),男,助理研究员,在职硕士,研究方向:实验动物病理学E-mail:511738602【通讯作者】王红星(1953-),男,研究员,研究方向:实验动物学,E-mail:whx6633 许跃忠1钟浩1杨玲1李韵2王红星1·(1.四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所,成都610212;2.四川大学华西医院病理科,成都610041)【摘要】目的:研究尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型脑组织形态学及尼氏小体的影响。方
2、法:应用经典的线栓法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO),2h后适当抽出线栓进行再灌注。脑缺血后第0h、24h、47h时经静脉给予尼莫地平注射液(1.0mg/kg/d),并观察动物的神经行为学、脑梗死比率(TTC染色法)、脑组织形态学和尼氏小体数量。结果:尼莫地平注射液能够明显改善MCAO模型大鼠脑缺血24h48h时的神经功能缺失体征,可使模型动物的脑梗死比率由18.32%降低至9.29%,能改善脑组织形态学病变和增加海马区神经元胞浆内的尼氏小体数目。结论:尼莫地平注射液对脑缺血急性期严重的脑组织形态学病变有改善作用,对神经细胞有保护作用,进而对脑梗死后的神经功能康复有促进作用。【关键词】尼莫地平注
3、射液;脑缺血再灌注损伤模型;脑组织形态学;尼氏小体The Effect of Nimotop Vial on Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury of MCAO Rat in Morphology AbstractObjective:to study the effects of nimotop vial on rat focal cerebric ischemia-reperfusion injury model in the sections of craniocerebral tissue morphology and Nissl's bod
4、y; Method: we employed classical cerebric ischemia-reperfusion injury model of MCAO, intravenous injected nimotop vial (1.0mg/kg/d) at the time points of 0h, 24h and 47h after being cerebral ischemia, and observed the changes of model animals in praxiology, cerebral infraction ratio(by TTC staining)
5、, craniocerebral tissue morphology and the number of Nissls body ; Results: nimotop vial can improve the nervous afunction symptoms of MCAO rats of being cerebral ischemia in 24h to 48h, can reduce the cerebral infraction ratio from 18.32% to 9.29%, can improve the craniocerebral tissue morphology a
6、nd can increase the number of Nissls body in the cytoplasma of hippocampus neuron; Conclusion: nimotop vial can improve the serious pathological changes of cerebral ischemia in acute stage, can protect nerve cells , and can improve the convalescence of nervous function after cerebral infraction.Keyw
7、ord: nimotop vial; cerebral ischemia-reperfusion injury model; craniocerebral tissue morphology; Nissl's body尼莫地平注射液在临床上常用于预防和治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛引起的缺血性神经损伤,但未见其对线栓法阻塞大脑中动脉致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)中动物脑组织和神经细胞的保护作用的研究,故本文较深入地研究了尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型脑组织形态学及尼氏小体的影响,为尼莫地平注射液的作用机制研究提供参考。1、材料和方法1.1试
8、验动物 SD大鼠,SPF级,120只,全雄,247±46g;由四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所提供, 生产许可证号:SCXK(川)2004-16。1.2尼莫地平注射液(尼膜同,NimodipineInjection) 由德国拜耳医药保健股份公司(Bayer HealthCare AG)生产,进口药品注册证号:H20050154。在本试验中确定尼莫地平注射液的临床成人用量为12mg/60kg/d,故大鼠的等效剂量为1.0mg/kg/d。1.3试验试剂及工具药 红四氮唑(Red tetrazolium):分子式为C19H15N4CL,上海灵锦精细化工有限公司,批号
9、:20080501。4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠溶液的配制:称取多聚甲醛 160g、NaH2PO4·2H2O 67.52g、NaOH 15.44g,加入4000ml蒸馏水,水浴(不超过60)溶解,不断搅拌,仍有大量不溶解的固体;放置过夜,水浴(不超过60)中滴加1M的NaOH溶液,至其中的可见物溶解为止,溶液仍不清晰,可取上层液使用。1.4试验器材 鱼线(2.5号,直径0.26mm,基本要求为:直径合格、有一定的硬度和曲度、韧性适度;由东洋南马银燕鱼鳔厂生产)。线栓的制备:取2.5号、直径0.26mm的优质浅绿色尼龙鱼线,剪取约7cm线段,将一端插入熔化石蜡中并迅速提起,垂吊晾
10、干,让石蜡自然下滴均匀覆盖前端线身。成品线栓显微镜下线头呈水滴状,线身直径达0.28mm。自此端始20mm处用白色修正液作一标记备用。1.5实验方法 将大鼠分为假手术组、模型对照组和尼莫地平注射液对照组,每组40只动物(因为该动物模型的死亡率较高,故在实验之初设置较多动物),每组再分为两个亚组,即TTC染色用亚组和脑组织形态学研究用亚组。参考文献1-3方法,腹腔注射水合氯醛将大鼠麻醉,仰卧位固定,术区常规消毒,颈正中线偏右切口,用止血钳钝性分离其下的淋巴组织及腺体。用眼科直镊和弯镊分离肌肉筋膜及右侧颈总动脉(CCA),于近分叉处绕线;继续分离颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),于分叉处结扎
11、ECA。再沿ICA往内约4mm处小心分离翼腭动脉,并齐分叉处结扎之;ICA近分叉处备线。然后在距CCA分叉处3mm用眼科剪剪一小口,在自制挑针的辅助下将拴线插入到ICA,用眼科镊轻轻送入约10mm,再顺势插入到20mm左右,以有抵触感为度,即实现对大脑中动脉的阻断(MCAO)。系牢ICA及CCA远心端的备线以固定线栓。滴加适量的庆大霉素稀释溶液,逐层缝合切口并消毒。术中保持肛温37±0.5,术后保温至动物清醒。MCA阻断2h后,动物开始有意识,适当抽出线栓约10mm,剪去漏出于皮肤外的线栓,进行再灌注。假手术组动物,仅在CCA、ECA、ICA及翼腭动脉处备线处理,待给予生理盐水后去线
12、即可。给药次数为三次,即脑缺血后第0h、24h、47h。具体方案为:用线栓阻断MCA成功后及缝合前,经右侧颈总静脉或其分支给予尼莫地平注射液溶液(0.2mg/ml),假手术组和模型对照组给予等体积生理盐水。再连续给药两天,均将动物麻醉后经舌下静脉给药。给药体积均为5ml/kgd。1.6观察指标4(1)神经行为学观察 参考Longa 及Bederson 的5 分制法,在动物麻醉清醒后第2h、24h、48h时进行评分。分值越高,说明动物行为障碍越严重。(2)脑梗死比率的测定 取“各组的脑TTC染色用亚组”的动物,在脑缺血后48小时,处死动物立即取全脑,进行TTC染色,测定脑指数和脑梗死比率。(3)
13、脑组织形态学 取“各组的脑组织形态学研究用亚组”的动物,在脑缺血后48小时,麻醉状态下经心脏灌流(4%多聚甲醛),取右脑做病理组织学研究,观察右侧大脑海马区的形态变化。(4)特殊染色(尼氏小体) 上述脑组织形态学研究用组织再同时进行石蜡切片,脱蜡,蒸馏水洗。1甲苯胺蓝水溶液至5060温箱染色2040min;蒸馏水稍洗;95乙醇迅速分化;无水乙醇脱水,二甲苯透明。中型树胶封固,光镜400倍下观察一个视野下的神经细胞尼氏小体数目。1.7统计方法 平均值间的差异应用SPSS 10.0 for windows软件提供的单因素方差分析或非参数检验进行处理。2、结果2.1神经行为学 结果详见表1。MCAO
14、模型大鼠主要在脑缺血后2h前后出现不能完全伸展右侧前爪及向左侧转圈等典型的脑缺血神经功能缺失体征(P<0.05),在脑缺血48h时基本恢复正常(P<0.01)。尼莫地平注射液能够明显改善MCAO模型大鼠脑缺血24h48h时的神经功能缺失体征(P<0.01)。表1 尼莫地平注射液对MCAO模型大鼠不同时间点时神经行为学的影响 ()组 别给药剂量(mg/kg/d)动物数(只)神经行为学评分(分)脑缺血2h脑缺血24h脑缺血48h假手术组350.00±0.00*0.00±0.000.00±0.00模型对照组312.37±0.911.27
15、77;0.590.36±0.15#尼莫地平注射液组1.0321.05±0.570.13±0.37#0.00±0.00#注:与模型对照组比较,*P<0.05,*P<0.01;与脑缺血2h比较,P<0.05,P<0.01。2.2脑梗死比率(TTC染色) 结果详见表2。MCAO模型大鼠脑缺血48h时脑梗死明显,脑梗死比率高达18.32%(P<0.01);尼莫地平注射液经静脉连续给药三次具有明显的治疗作用,可使脑梗死比率明显降低至9.29%(P<0.05)。表2 尼莫地平注射液对MCAO模型大鼠脑梗死比率的影响 ()组 别给药
16、剂量(mg/kg/d)动物数(只)脑梗死比率脑指数假手术组190.0000±0.0000*0.0054±0.0010模型对照组130.1832±0.11520.0058±0.0005尼莫地平注射液组1.0150.0929±0.0624*0.0061±0.0011注:与模型对照组比较,* P<0.05,* P<0.01。2.3脑组织形态学 除模型对照组外,其余各组送检脑组织结构基本正常,大致可见细胞层次,主要病变为不同程度脑实质内血管充血、出血,或血管周水肿,不同程度脑细胞水肿、或灶性溶解;脑膜及室管膜水肿、血管充血、出血。
17、部分脑内灶性间质细胞增生。模型对照组部分脑实质结构模糊,上述病变重。详见图13。应用“病理分级标准”和“病理评分方法”将上述描述性结果转换为计量数据,以便进行组间比较分析,结果如表3所示。MCAO造模成功,可引起较严重的脑组织形态学病变(P<0.01),而尼莫地平注射液经静脉连续给药三次具有明显的治疗脑组织形态学病变的作用(P<0.01)。表3 灯盏细辛注射液对MCAO模型大鼠脑组织形态学的影响 ()组 别给药剂量(mg/kg/d)动物数(只)病理学评分(分)尼氏小体数(个)假手术组105.26±1.45*11.17±2.14*模型对照组1022.01±
18、;5.623.47±0.12尼莫地平注射液对照组1.01012.38±3.28*9.01±2.91*注:与模型对照组比较,* P<0.05,* P<0.01。附:病理分级标准+:小灶性灰、白质细胞或间质轻度水肿,小灶性细胞溶解;灶性少许细胞增生(增生细胞主要为胶质细胞);脑实质内轻度血管周水肿;轻度血管充血、出血;轻度脑膜或室管膜水肿、充血、出血。符合其中一项者,即判定为“+”。+:多灶性灰、白质细胞或间质水肿,细胞溶解;脑实质内血管中度充血、出血;中度血管周水肿。脑膜或室管膜水肿、充血、出血较重。符合其中一项者,即判定为“+”。+:弥漫性灰、白质细胞
19、或间质水肿,大片细胞溶解;脑实质内血管重度充血、出血、血管周水肿。脑膜或室管膜水肿、充血、出血明显加重。符合其中一项者,即判定为“+”。附:病理评分方法灰质病变分为细胞水肿、溶解坏死、血管周水肿、充血、出血、间质细胞增生六项,白质病变分为细胞水肿和灶性溶解两项,脑膜及室管膜病变分为水肿、充血和出血三项,观察每个样本上述各项病变情况,参照上述分级标准,“+”记1分,“+”记2分,“+”记3分,每个样本各项指征累积计分,作为该样本最终病理学评分。2.4尼氏小体 结果详见表3和附图46(照片中的黄色箭头所指为尼氏小体)。脑缺血假手术组大鼠海马区神经细胞胞浆内可见较多深蓝色颗粒状的尼氏小体,着色均匀,
20、神经元形态正常;与假手术组比较,模型对照组动物的神经细胞胞浆内尼氏小体少见或消失(P<0.01),着色浅淡不均匀,神经元胞体轻度肿胀。与模型对照组比较,尼莫地平注射液组动物海马区神经元胞浆有相对较多的尼氏小体分布(P<0.05),着色较均匀,染色较深。(见附图)3、结论和讨论MCAO模型大鼠主要在脑缺血后2h前后出现不能完全伸展右侧前爪及向左侧转圈等典型的脑缺血神经功能缺失体征,在脑缺血48h时基本恢复正常。尼莫地平注射液和灯盏细辛注射液中剂量能够明显改善MCAO模型大鼠脑缺血24h48h时的神经功能缺失体征。脑组织形态学研究结果表明,MCAO造模能够引起较严重的脑组织形态学病变,
21、主要为不同程度脑实质内血管充血、出血,或血管周水肿,不同程度脑细胞水肿、或灶性溶解;脑膜及室管膜水肿、血管充血、出血;部分脑内灶性间质细胞增生。尼莫地平注射液对MCAO大鼠脑组织形态学病变具有明显的治疗作用。尼氏小体(Nissls Body, Nissl granules)是指神经细胞中特异性嗜碱性颗粒群,呈粒状、微粒状或虎斑状,分散在神经元除轴突和轴丘以外的胞浆中,又称为虎斑样物质。尼氏小体是糙面内质网核糖体中的核蛋白,其化学本质是核糖核酸及蛋白质,其主要作用是合成蛋白质。尼氏小体是神经细胞功能活性的形态指标,其功能与神经元的功能具有非常密切的关系,故常作为判断神经细胞存货的标志,以及是否发生病理生理变化,观察尼氏小体的变化基本能反映海马神经细胞的情况。尼氏小体是对缺血、缺氧等损害反应非常敏感的细胞器,特别是当轴突受到损害时,神经细胞内的尼氏小体趋向溶解或消失,以运动神经元最明显。脑缺血48h后大鼠海马区神经细胞胞浆内尼氏小体的数目明显减少,而尼莫地平注射液治疗能减轻脑梗死后尼氏小体减少,并且进一步促进尼氏小体的数量的增加,从而提高神经轴突再生及神经生长锥的延长,提示尼莫地平注射液对脑缺血急性期的神经细胞有保护作用,对脑梗死后的神经功能康复有促进作用。综上所述,普通脑组织形态学研究和特殊染色的尼氏小
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