超高效液相色谱_串联质谱法快速检测鳗鱼中磺胺类_喹诺酮类_四

1、超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鳗鱼中磺胺类、喹诺酮类、四环素族抗生素药物残留刘正才,杨 方,余孔捷,李耀平,林永辉,张 琼,刘素珍(福建出入境检验检疫局,福建 福州 350001摘要:建立鳗鱼中15种磺胺、3种喹诺酮类以及4种四环素族抗生素残留的超高效液相色谱-串联质谱同时测定方法。采用酸性EDTA-Mcllvaine 缓冲液提取,经HLB 固相萃取小柱富积、净化后进行UPLC 分离,电喷雾串联质谱进行检测,多离子反应监测(MRM模式定量。添加水平为5、10、20g/kg 时各种化合物的平均回收率范围为72.4%97.3%,RSD 值均小于14.4%。该法简单、快速、灵敏,适用于鳗鱼中多磺

2、胺组分、喹诺酮及四环素族组分残留的同时测定。关键词:超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS-MS;磺胺类;喹诺酮类;四环素族;鳗鱼Simultaneous Determination of Qunolones, Sulfonamides and Tetracyclines Residues in Eel Using Solid PhaseExtraction (SPE and Ultra-performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem MassSpectrometry (UPLC-MS-MSLIU Zheng-cai ,YANG F

3、ang ,YU Kong-jie ,LI Yao-ping ,LIN Yong-hui ,ZHANG Qiong ,LIU Su-zhen(Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, ChinaAbstract :A robust and sensitive UPLC-MS-MS method was developed for the simultaneous determination of residues of 15sulfonamides, 3 fluoroquinolones and 4 te

4、tracylines in eel. The target compounds were extracted with acidic EDTA-Mcllvaine buffer solution, and enriched and cleared up using a hydrophilic-lipophilic balance (HLB SPE cartridge. After seperation on UPLC BEH C 18, the analytes were detected using a tandem mass spectrometry and quantified in m

5、ultiple reaction monitoring (MRMmode. At the spike levels of 5, 10 and 20g/kg respectively, the average recoveries for all the compounds were 72.4%-97.3%,and the variation coefficients were all under 14.4%. This method is simple, fast, sensitive, and particular for the simulaneous determination of s

6、ulfonamides, fluoroquinolones and tetracylines in eel.Key words :ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS-MS;sulfonamides ;qunolones ;tetracycline ;eel中图分类号:TS207.53 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(200914-0167-04收稿日期:2008-10-18基金项目:国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2007IK147;福建省科技计划重点项目(2007

7、Y001作者简介:刘正才(1977-,男,工程师,硕士,主要从事农兽药残留分析。E-mail :zhengcailiu由于现代养殖的集约化,饲料药物添加剂和各类抗生素在生产中被广泛应用,以及用药混乱等因素存在,使水产品药物残留问题日益突出。磺胺类、喹诺酮类以及四环素族抗生素是常见的合成抗生素,在畜禽和水产养殖中使用十分普遍。但这些药物在食品中的残留会严重危害人类的健康,如磺胺类残留能破环人的造血系统,造成溶血性贫血症1;喹诺酮类药物可发生中、重度光敏反应和光毒性反应,可致重症肌无力症状加重、呼吸肌无力而危及生命,且有潜在的致癌性和遗传毒性2;四环素类抗生素进入人体会干扰人体的正常生理机能,影响

8、儿童和青少年的生长发育,降低人体对致病菌的抵抗能力3。由此可见,必须对食品中以上药物残留进行监控,开发出一套操作简便、准确性好、应用范围宽的分析检验方法。目前这些抗生素检测方法有酶联免疫法4、放射免疫法5、液相色谱法6-7、液相色谱-质谱法4-11等。但是,这些检测方法大多是针对单一类别药物的检测,随着兽药残留应用越来越多样化、复杂化,对于兽药残留检测已不仅仅局限于单一类别药物残留检化合物简写保留时间母离子锥孔子离子质荷比及其碰撞能量(eV(min质荷比电压(V磺胺嘧啶SD 1.65250.822155.8*(15; 108.1(20磺胺甲基嘧啶SM 2.23264.824155.8*(17;

9、 171.8(16磺胺二甲嘧啶SM2 2.84278.926155.8*(18; 185.8(16磺胺间甲氧嘧啶SMM 3.03280.824155.8*(19; 214.8(18磺胺二甲氧SDM 3.84310.928 244.8(18; 155.9*(20磺胺邻二甲氧嘧啶SDML4.38310.926155.9*(20; 108.1(24磺胺甲基异噁唑SMZ 3.62253.924155.9*(16; 108.1(22磺胺甲氧嗪SMP 3.03281.025155.8*(16; 126.0(19磺胺氯达嗪SCP 3.37284.824155.8*(15; 108.0(24磺胺脒SG 1.3

10、7214.928155.8*(14; 108.0(20磺胺醋酰SPD 1.37214.818155.8*(11; 108.0(19磺胺甲噻二唑SMT 2.82270.820155.8*(14; 108.1(24磺胺吡啶SP 2.08249.920155.8*(18; 183.8(17磺胺对甲氧嘧啶SMD 2.69280.821155.8*(19;214.8(18磺胺二噻唑STZ 1.93255.826155.7*(15; 108.1(22恶喹酸O X O 4.41262.230244.0*(18; 216.0(28氟甲喹FLU 4.78262.230244.0*(18; 202.0(32萘定酸

11、NAL 4.71233.228215.0*(15; 187.0(25土霉素OTC 3.29461.127425.9*(22; 443.1(15四环素TC 3.33445.225427.0*(15; 410.0(20金霉素CTC 4.31479.125443.1*(22; 461.0(15强力霉素DCT3.33445.225428.3*(16; 409.0(20表1各类药物的质谱条件参数Table 1 MS/MS parameters for the analysis of qunolones,sulfonamides and tetracyclines注:*.定量离子;其他为定性离子。测,单类

12、兽药残留检测存在耗时耗力、低效率等弊端,目前世界上很多国家都在重点研究多类残留的同时检测12-13。本实验拟根据磺胺类、喹诺酮类以及四环素族抗生素的结构特点,参考各类药物已有的提取、净化方法,通过日常检测的反复试验和验证,在原有检测方法上加以改进,以期探索出一套能同时提取和检测三类抗生素的快速检测方法,以实现对生物样品中低含量、多组分抗生素的同时测定。1材料与方法1.1材料与试剂乙二胺四乙酸二钠(Na 2EDTA 2H 2O 上海天莲精细化工有限公司;柠檬酸(C 6H 8O 7H 2O 上海申博化工有限公司;磷酸氢二钠(Na 2HPO 412H 2O 上海青析化工有限公司;乙腈、甲醇、甲酸(均

13、为色谱纯,德国墨克公司;Mill -Q 超纯水;磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲氧嗪、磺胺氯达嗪、磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二噻唑、恶喹酸、氟甲喹、萘定酸 德国Dr .Ehremstorfer 公司;土霉素、四环素、金霉素、强力霉素(纯度均大于等于90%Sigma-Aldrich 公司;用甲醇分别配制成1.0g/L 储备液,置于棕色容量瓶避光4保存,临用时根据需要稀释成适当浓度的混合标准溶液。EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液(0.1mol/L:称取11.8g 柠檬酸-水合物,13

14、.72g 磷酸氢二钠二水合物,33.62g EDTA-2Na 溶解于1L 水中,溶解摇匀后用氢氧化钠或盐酸调节pH 值至4.5。1.2仪器与设备超高效液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源ESI 及Mass.1ynx4.0数据处理软件、固相萃取装置、OASIS HLB 固相萃取小柱(3ml ,60mg、Acquity UPLC BEH C 18柱(55mm 2.1mm ,1.7m Waters 公司;离心机 美国Beckman Coulter 公司;高速组织捣碎机 德国IKA 公司;涡旋混合器 上海医科大学仪器厂; MilliQ 纯水系统 Millipore 公司;0.22m 微孔滤膜。1.3

15、仪器条件1.3.1色谱条件色谱柱为Acquity UPLC BEH C 18柱(55mm 2.1mm ,1.7m;流动相A :5mmol/L 醋酸铵-0.2%甲酸(100:0.2,V/V ;流动相B :甲醇;梯度洗脱程序:起始比例B 为10%,经2.5min 升至25%,并维持0.5min ,之后用1.2min 升至80%,用0.3min 升至90%,持续0.7min 后,用0.5min 回复至10%,然后维持0.5min ,总分析时间为5.5min 。流速为0.25ml/min ,进样量10l 。1.3.2质谱条件电离方式:ESI +;电离电压:3.5kV ;锥孔电压:25V ;离子源温度:

16、115;锥孔反吹气流速:50L/h ;脱溶剂气温度:320;脱溶剂气流速:750L/h ;碰撞室压力:3.610-5Pa ;采用MRM 分析。22种化合物优化后的质谱参数及其保留时间见表1。1.4样品制备鳗鱼取连皮的鱼肉,置于微波炉中加热后放入高速组织捣碎机均质,充分混匀,装入清洁容器内,并标明标记。1.5样品前处理称取均质试样5.0g(精确到0.01g,置于50ml 聚丙烯离心管中,分别加入2.0ml 乙腈、38.0ml 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液,旋涡混合1min ,然后冰水浴超声提取10min ,4500r/min 离心5min(温度低于15,取出上清液并定

17、容至50ml ,混匀,4500r/min 离心2min ,净化。Oasis HLB 固相提取小柱用5ml 甲醇和5ml 水活化后,准确吸取8.0ml 提取液过HLB 固相萃取柱,待样液完全流出后,依次用3ml 水和3ml 甲醇-水(5:95,V/V 淋洗,弃去全部流出液。减压抽干5mi n ,最后用5m l 甲醇和5ml 乙酸乙酯洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干(温度低于40,用1.0ml 甲醇-甲酸-水溶液(5:0.5:94.5,V/V 化合物标准曲线方程相关系数(rLOQ(g/kgSD Y =844.675X -108.0540.9960 1.5SM Y =696.358X -204.0340.

18、9962 1.0SM2Y =1536.33X -124.5970.9990 1.5SMM Y =407.619X -88.75990.9988 2.0SDM Y =2853.22X +506.940.99750.5SDML Y =1625.29X -27.19880.99560.5SMZ Y =779.672X -166.7540.9969 2.0SMP Y =1171.74X -265.1780.9968 1.0SCP Y =327.281X -82.36070.9977 2.0SG Y =256.873X +112.0960.9965 5.0SPD Y =1393.01X +460.488

19、0.9954 2.0SMT Y =557.828X +61.54650.9990 1.0S P Y =1084.01X -142.3600.9958 1.0SMD Y =594.967X -214.890.9983 1.0STZ Y =201.083X +19.3000.9959 2.0OXO Y =1711.6X +495.4610.9971 2.0FLU Y =6762.12X +3090.940.9952 1.0NAL Y =11081.5X +4500.170.9950 1.0OTC Y =74.4191X +12.27350.9973 5.0T C Y =517.529X +91.1

20、8920.9951 2.5CTC Y =132.465X +3.697820.9951 5.0DCTY =523.098X -16.48690.99775.0表2各组分线性回归方程和定量下限Table 2 LOQ and regression equation for each compound 5g/kg 10g/kg 20g/kg 化合物平均回收率RSD 平均回收率RSD平均回收率RSD (%(%(%(%(%(%SD 82.410.486.59.885.710.1SM 83.69.184.28.592.37.8SM280.88.985.47.890.2 6.3SMM 82.17.890.2

21、 4.888.9 6.7SDM 78.512.480.59.082.1 6.9SDML 79.89.178.48.781.97.3SMZ 87.6 6.488.77.893.2 5.6SMP 90.67.589.5 5.391.9 3.9SCP 87.07.890.3 6.995.47.5SG 72.510.978.99.481.710.9SPD 80.58.685.77.990.6 6.8SMT 76.99.184.310.384.78.8S P 81.28.085.29.384.4 4.2SMD 92.47.395.3 6.097.3 3.5STZ 89.514.491.510.993.7

22、8.5OXO 72.47.880.29.879.17.1FLU 75.28.178.78.081.89.5NAL 77.310.079.37.183.2 6.7OTC 82.58.987.59.386.8 4.7T C 85.3 5.786.57.585.98.0CTC 81.77.885.0 6.787.97.1DCT83.26.982.98.785.27.0表3鳗鱼加标回收率和相对标准偏差(n = 6Table 3 Recoveries for 22 compounds in eel spiked at 5, 10 and20g/kg (n = 6溶解残渣,混匀后过0.22m 滤膜,待测定

23、。2结果与分析2.1流动相的选择因所分析的化合物中大多含有-COOH 或-NH 2基团,在流动相中加入甲酸,可以有效改善峰形,还可增加其离子化效率,另外,流动相中加入少量的乙酸铵,可以增强一些药物的电离效果,经实验证明,流动相中加入5mmol/L 乙酸铵和0.2%甲酸(100:0.2,V/V 可以同时较好的分离3类药物,离子化效果较好。2.2提取溶剂的选择磺胺类以及喹诺酮类抗生素药物的提取一般采用有机试剂提取,如乙腈、二氯甲烷等,但有些磺胺类药物因为苯环上的氨基与还原糖的醛基作用,形成糖结合物14,加入少量的有机溶剂有利于磺胺类的提取。本实验采用pH4.5 0.1mol/L EDTA-Mcll

24、vaine 缓冲溶液-乙腈(19:1,V/V 作为提取溶剂可以释放出与基体结合的化合物,对三类化合物的提取回收率都能达到满意的结果。2.3固相萃取中洗脱液的选择在鳗鱼组织样品中含有大量的油脂和蛋白等杂质,干扰正常化合物的检测,因此必须进行净化,本实验采用反相固相萃取小柱Waters Oasis HLB SPE 柱进行净化,效果比较好。由于多组分药物的极性差异很大,因此选取了有极性差异的甲醇和乙酸乙酯作为洗脱液。2.4方法学验证2.4.1标准曲线和定量限配制浓度为0、1、2、5、10、20、50、100、200ng/ml 的混合标准系列,以各组分的峰面积(Y 对浓度(X 绘制标准曲线,各种化合物

25、标准曲线方程和相关系数见表2。结果表明,各种化合物的质量浓度在0200ng/ml 范围内线性良好,相关系数(r 均大于0.9900。以信噪比为10所对应浓度计算定量限(limit of quantitation ,LOQ,以取样量为5.0g ,分取比例1/5、定容体积1.0ml 时,进样量10l ,各组分定量限在0.55.0g/kg 之间。2.4.2方法精密度和回收率取5.00g 不含上述药物的空白鳗鱼均质样品,分别进行5、10、20g/kg 3个添加水平的回收率和精密度实验,每个添加水平测试6个平行样品,其平均回收率和精密度结果见表3。从表3中回收率及精密度数据可以看出,平均回收率在72.4

26、%97.3%之间,相对标准偏差在3.5%14.4%之间,说明方法重现性很好,各种指标均满足残留分析的要求。3结论本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法对22种抗生素药物进行快速筛选和测定,方法的定量限(LOQ在0.55.0g/kg 之间,获得了极高的检测灵敏度,满足了低含量样品的测定。该方法避免了使用大量有机溶剂,且具有快速、准确、适用范围广等优点,并在本地区进出口水产品检验检疫中得到很好的应用。参考文献:1农业部新编鱼药手册编撰委员会. 新编鱼药手册: 1分册M.北京: 中国农业出版社, 2005: 191.2李俊锁, 邱月明, 王超. 兽药残留分析M. 上海: 上海科学技术出版社, 2002

27、: 257-275.3滑静. 动物性食品中四环素类药物残留的检测方法J. 动物科学与动物医学, 2004, 21(7: 26-27.4郑晶, 黄晓蓉, 郑俊超, 等. 微生物抑制法与酶联免疫法检测鳗鱼中喹诺酮类药物残留的比较研究J. 中国卫生检验杂志, 2006, l6(1: 79-81.5WILLEM H. Application of an enzyme immunoassay for the determina-tion of sulfamethazine residues in swine urine and plasma and their use as predictors of

28、the level in edible tissueJ. Food Additives and Containinants, 1996, 13(7: 811-822.6方炳虎, 何绮霞, 邹潍力, 等. 牛奶中12种磺胺类药物残留的高效液相色谱测定方法J. 分析测试学报, 2007, 26(4: 519-522.7汤瑶, 何华, 吴斌, 等. 固相萃取-HPLC法测定蜂蜜中残留的10种磺胺类药物J. 分析测试学报, 2005, 24(1: 96-99.8JAY E R, HUANG C H. Simultaneous determination of fluoroquinolone,sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extraction and liquid chromatography-electrospray mass