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1、1.工具酶的概念工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称应用与基因工程的各种酶的总称.切切:连连:修饰修饰:(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：具有三种酶活性a、5 -3DNA聚合酶活性CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCTGGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGAb、3 -5 外切酶活性CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCGGCG Mg2+ dNTP GCGc、5 -3外切酶活性CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAGGCGTAATC Mg2+ G

2、CGTAATC(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5 -3外切酶活性Klenow酶的基本用途：a.补平由核酸内切酶产生的5粘性末端b.DNA片段的同位素末端标记c.cDNA第二链的合成d.双脱氧末端终止法测定DNA序列连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNA分分子。子。(1). T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 不受不受dNTP的抑制，催化的抑制，催化DNA片断的连接。片断的连接。(2). E.coli DNA连接酶连接酶 不能连接平端不能连接平

3、端DNA,不能连接不能连接RNA。去除去除DNA或者或者RNA的的5磷酸，可防止自身环磷酸，可防止自身环化。化。 5pDNA 5OHDNA 5pRNA 5OHRNA分子量分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催在二价阳离子的作用下，催化化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端。羟基端。底物：底物： 带带3羟基端单链羟基端单链DNA或带或带3羟基突出端的羟基突出端的双链双链DNA。S 1 核 酸 酶 的 基 本 特 性 ： 来 自 稻 谷 曲 霉 菌核 酸 酶 的 基 本 特 性 ： 来 自 稻 谷 曲 霉 菌（Aspergillus oryzae）水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端，水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端，产生产生5核苷酸和核苷酸和5末端为末端为p的寡核苷酸。的寡核苷酸。Zn2+必需必需,最适最适pH范围为范围为4.0 - 4.3,需要需要NaCl 10 - 300 mM. 降解单链降解单链DNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNA快快75000倍倍8 .T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶催化催化ATP的的-磷酸基团转移到磷酸基团转移到DNA或或RNA的的5末端。末端。用途：用途：1 .标记标记DNA5末端。

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