活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子mRNA表达的影响

1、活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子mRNA表达的影响        【摘要】  目的观察活血熄风方对局灶性脑缺血模型大鼠脑梗塞体积及脑组织中血管内皮生长因子（VEGF mRNA）表达的影响。方法Wistar雄性大鼠随机分为假手术组，模型组，活血熄风方高、中、低3个剂量组（剂量分别为20，10，5 g·kg-1）和尼莫地平对照组（0.02 g·kg-1），采用光化学法建立局灶性脑缺血大鼠模型，造模前7d灌胃给药，造模后24 h 取材，TTC染色法测脑梗塞体积，逆转录聚合酶链式反

2、应（RT-PCR）法测VEGF mRNA表达。结果 与模型组比较，活血熄风方各剂量组的脑梗塞体积明显减少（P0.01），VEGF mRNA表达明显升高 (P0.01)。结论活血熄风方可明显减少局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积，具有脑保护作用，其作用机制可能与增强VEGF mRNA表达有关。 【关键词】  活血熄风方；光化学法；血管内皮生长因子mRNA； 逆转录聚合酶链式反应； 局灶性脑缺血  ChinaAbstract:ObjectiveTo observe the effects of  Huoxue Xifeng Recipe (HXR) on infarction

3、 volume and the expressions of VEGF mRNA in brain tissue after focal cerebral infarction(FCI) in rats.MethodsWistar male rats were randomly divided into six groups: sham group, model group, HXR treated group(20，10，5 g·kg-1 as high，middle and low dose respectively) and nimodipine control group(0

4、.02 g·kg-1). The model of FCI was established based on the principle of photo-chemistry initiation of thrombosis, intragastric administration continued 7 days before modeling and draw the material after 24h. Infarction volume was detected by TTC staining technique, the expression of VEGF mRNA w

5、as detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). ResultsThe infarction volume was decreased and the expressions of VEGF mRNA was higher in HXR trerted groups than that of FCI model rats (P0.05 or P0.01).ConclusionHXR can decreased infarction volume and has a protective effect

6、on FCI rats, and the mechanism may be related to increasing the expression of VEGF mRNA.Key words:Huoxue Xifeng Recipe;  Photo-chemistry;  VEGF mRNA;  RT-PCR;  Focal cerebral infarction    脑缺血后，由于脑组织缺血、缺氧，缺血中心区细胞迅速死亡，半暗区神经细胞处于低氧、低灌注状态，及时恢复该区域血流供应有望改善患者的神经功能。而半暗区血流的

7、恢复有赖于侧枝循环的建立，血管再生是决定这些细胞存活的关键因素，与缺血性脑卒中病人的预后关系密切1。在血管再生过程中，众多因子参与调节，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 是已知作用最强和特异性最高的促血管生长因子2，在血管生成和神经保护方面发挥着重要作用。    活血熄风方是在“淤血生风”假说3基础上提出的中风的新组方，全方以活血化淤为主，通过活血化淤以求逐淤熄风，经临床验证疗效满意，已有实验证实活血熄风方具有脑保护作用4。本实验用TTC染色法观察光化学法诱导的局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积大小，采用R

8、T-PCR技术观察VEGFmRNA的表达以及活血熄风方对上述方面的干预作用，来探讨活血熄风方脑保护的作用机制。1  材料与仪器1.1  动物健康雄性Wistar大鼠，体质量200250g，山东鲁抗医药有限公司提供合格证号：SCXK(鲁)20050017。1.2  药物活血熄风方，由当归、红花、川芎、水蛭等药物组成，蒸馏水浸泡1 h，水煎2次，30 min/次，两次煎液混匀，旋转蒸发仪分别浓缩至2，1，0.5 g·ml-1，4保存备用。尼莫地平片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产，每片20 mg，使用前用蒸馏水溶解成含量为2 mg·ml-1的

9、混悬液。1.3  试剂与仪器Trizol  Reagent（美国 Invitrogen）；DNA Marker DL2000、Taq 酶、Ribonuclease inhibitor、dNTP  Mixture（大连宝生物）；M-MLV Reverse Transcriptase（美国 Promega）；玫瑰红(美国Sigma) ；红四氮唑(TTC) （化学纯，北京化工厂）。    梯度PCR系统（ICYCLER型，美国BIO-RAD公司）；DXY-2稳压稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（Gel Doc 2000型，

10、美国BIO-RAD公司）；低温高速离心机（Sigma3k30，德国Sigma公司）；紫外分光光度仪（UV-1601 型，日本岛津）；立体定位仪（美国Stoelting公司）；IPP图像采集分析系统（美国）。2  方法2.1  分组与给药大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、活血熄风方高剂量组、活血熄风方中剂量组、活血熄风低剂量组、尼莫地平对照组，每组12只，其中6只用于TTC染色，6只用于RT-PCR。各组均给予手术造模，假手术组股静脉注射药物为生理盐水，其余操作同模型组。各组造模前7 d灌胃给药，活血熄风方高、中、低剂量组分别给予活血熄风方20，10，5 g·kg

11、-1·d-1，对照组给予尼莫地平0.02 g·kg-1·d-1，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。1次/d，末次给药1 h后造模。2.2  局灶性脑缺血性大鼠模型的制备采用光化学法诱导制备局灶性脑缺血性大鼠模型，根据Waston等5的方法略加改动，具体方法如下：室温25条件下，雄性Wistar大鼠10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，立体定位仪固定大鼠头部，常规消毒后，沿头正中切口分离至暴露完整的颅骨，以矢状缝右侧3 mm，冠状缝后3 mm为中心用牙科平钻开直径约6 mm的骨窗，去除颅骨表层骨板，保留下层骨板及硬脑膜，经股静脉缓慢注

12、入5%玫瑰红80 mg·kg-1，时间为1 min，注射结束5 min后用冷光源照射骨窗20 min。2.3  TTC染色测脑梗塞灶体积造模后24 h，大鼠麻醉后迅速断头取脑，预冷生理盐水冲洗残血，去掉嗅球、小脑和低位脑干，-20冰冻脑组织20 min，在视交叉处冠状位切脑，其后间隔2 mm连续做6个冠状切片，迅速放入2% TTC溶液中，37恒温孵育20 min，染色后置4%多聚甲醛中固定，正常组织为红色，缺血区为白色，24 h后用扫描仪将图像扫描输入电脑，采用图像采集处理系统软件测量梗塞灶面积，各脑片梗塞面积之和乘以厚度为总的梗塞体积。2.4  RT-PCR法测

13、脑组织VEGF mRNA表达大鼠造模后24 h，麻醉后迅速断头取脑，取缺血侧大脑顶叶皮层，液氮速冻后，-70冰箱保存备用。2.4.1  总RNA 的提取用Trizol常规方法提取大脑皮层总RNA，紫外分光光度计260280 nm测RNA浓度，1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。2.4.2  RT-PCR 反应取2 g总RNA经逆转录酶M-MLV催化合成cDNA。VEGF mRNA和内参照酸性核糖体磷蛋白P0(Acidic ribosomal protein P0，Arbp)引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成。引物序列如下：VEGF ：5- TGGACCCTGGCTT

14、TACTGCTG -3 （上游），5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA -3（下游），扩增片段为 127bp；Arbp： 5- GCGTCTGTCTGCAGATTGGCTA -3' (上游)， 5-CAGATGGATCGGCCAGGAA -3(下游)，扩增片段为 150bp。采用50l反应体系进行扩增，反应参数为：Arbp95预变性4 min，94变性30 s，60退火30 s × 30个循环，72终末延伸4 min。VEGF：954 min，9430 s，6030 s，7220 s×35个循环； 72终末延伸7 min。2.4.3  半定量分析

15、扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，在电压为 5V·cm-1及稳流的条件下进行电泳，用Quantity One分析软件进行光密度扫描，测定各组 PCR 产物密度值与内参照Arbp PCR 产物密度值。用各组目的基因片段（VEGF）密度值/内参基因片段（Arbp）密度值的比值进行比较。2.5  统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行统计处理，所有数据均用±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，成组数据比较采用t检验，以P0.05 为具有统计学意义。1         3  结果

16、3.1  活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响大鼠脑组织经TTC染色后，除假手术组外均在照射区大脑皮层出现白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，边界清晰，冠状面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向侧脑室，深达皮质全层，表明造模成功。活血熄风方各剂量组及尼莫地平组脑梗塞灶体积均较模型组减小，统计学差异显著(P0.01)。活血熄风方各剂量组与尼莫地平对照组比较，无明显差异（P0.05）。结果见表1，图1。表1  活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响（略）3.2  活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑组织VEGF mRNA 表达的影响与假手术组比较，模型组 VEGF mRNA 表

17、达有所升高（P0.01）。与模型组比较，活血熄风方各剂量组与尼莫地平组均可显著上调脑组织 VEGF mRNA的表达（P0.01），且活血熄风方各剂量组 VEGF mRNA 表达相对含量均明显高于尼莫地平对照组（P0.01）。见表2，图2。表2  对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞边缘区VEGF mRNA表达的影响（略）4  讨论    在缺血性脑血管疾病的研究中人们注意到，VEGF及其受体的促血管形成作用对缺血半暗区血供的改善和侧枝循环的建立具有重要意义。VEGF是内皮细胞特异性的有丝分裂原，具有促进内皮细胞增殖，提高血管通透性等生物学特性。脑缺血后，低

18、氧可激活VEGF及其受体系统，促使缺血半暗区VEGF表达，VEGF诱导大量新生血管形成，促进血管增生，增加受累组织的血流灌注和供氧量，减少神经元的凋亡和死亡，减轻脑损伤程度6。    目前发现VEGF主要有Flkl和Flt两个特异性受体，其中Flkl是发挥生物活性的主要受体7，VEGF与其受体结合后在血管生成和神经保护方面发挥着重要作用8。当脑缺血时，VEGF表达增强，并特异性与Flkl 结合发挥作用。刘氏等9采用原位杂交方法，结果显示，VEGF mRNA主要在缺血半暗区神经元表达，同时在胶质细胞和血管内皮细胞亦有表达。缺血后48 h半暗区周边出现血管增生，并逐渐

19、向中心区延伸，于缺血后7d达高峰，整个缺血半暗区可见明显血管增生。    近年来，研究人员开始尝试利用生长因子能够促进血管发生及生长的原理，缺血性血管疾病。目前的治疗性血管新生方法中最常用的是外源性促血管生成生长因子的基因治疗与重组蛋白质治疗，但均存在一定限制和困难10，11。中医学认为，缺血性中风的病机特点是气血逆乱，“血菀于上”，即淤血不通，脑脉痹阻，因此临床常采用活血之法，而活血可祛淤，淤血去则新血生，称之“祛淤生新”。生新不仅是传统意义上的生新血，应当还包含有生新络的含义，淤血去则新血及新络生，生新又反过来促进淤血的祛除，这与治疗性血管新生有相同之处。VE

20、GF 是已知作用最强和特异性最高的促血管生长因子，因此也是体现“祛淤生新”的重要指标。    本实验TTC染色发现，与假手术组相比，光化学法诱导的局灶性脑缺血模型大鼠大脑皮层出现明显的梗塞灶（P0.01），同时发现梗塞区周围脑组织VEGF mRNA 表达有所升高（P0.01）。而与模型组相比，活血熄风方各剂量组能明显减少梗塞灶体积（P0.01），同时明显上调VEGF mRNA的表达（P0.01），且明显优于尼莫地平对照组（P0.01）。    活血化淤治疗脑缺血的一个重要方面是祛淤血生新络，本实验采用具有活血作用的活血熄风方，从器官水

21、平上观察了活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响，从基因水平上观察了对脑组织VEGF mRNA表达的影响。本实验结果显示，活血熄风方可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞体积，具有明显的脑保护作用，其作用机制可能与增强局灶性脑缺血大鼠梗塞周围脑组织VEGF mRNA表达，从而促进缺血半暗带区的血管新生有关。【】  1Krupinski J,Kaluza J,Kumar P, et al. Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic strokeJ.Stroke,1994,25 (9 ):1794.2金惠铭,李先涛.血管新

22、生的调控J.微循环杂志,2001,5(2):85.3刘昭纯，马月香，刘红杰，等 “瘀血生风”假说的形成及意义J.中国中医基础医学杂志，2005，11(3)：88.4高红莉，刘昭纯 活血熄风方对局灶性脑缺血模型大鼠的保护作用J.新中医，2008，40(2)：100.5Watson BD，Dietrich WD，Busto R，et a1 Induction of reproducible brain infarction by photo chemically initiated thrombosisJ.Ann Neurol，1985，17(5)：497.6Yang Zeng jin,Bao Wei li,Qiu Mei hong,et al. Role of Vascular endothelial growth factor in neuronal DNA damage and repair in rat brain following a transient cerebral ischemiaJ.Neurosci Res,2002,70:140.7Meister B J,Gminekich F,Bacttj