甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用

1、甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用基金项目：国家自然科学基金项目（30400352）；教育部重点项目（205045）；黑龙江省自然科学基金（D200611）；黑龙江省研究生创新基金（YJSCX2006-0077HSD）作者简介：季宇彬(1956-)，男，教授，博士生导师，研究方向为肿瘤药理学的研究。季宇彬1,2，冯小燕1,2，高世勇1,2（1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨150076；2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076）摘要：研究甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。应用MTT法观察体外甜菜碱在不同浓度、不同时间对小鼠脾淋巴细胞

2、增殖的影响，应用流式细胞仪（FCM）测小鼠脾淋巴细胞在不同时间周期的变化。结果表明：甜菜碱终浓度0.4mM、4mM、20mM均可促淋巴细胞增值，但终浓度4mM效果最为明显，在甜菜碱刺激24h、48h、72h后，淋巴细胞均可显著增值，但随时间的加倍，增值幅度并不明显，综合考虑，24h效果更好。终浓度4mM甜菜碱不同时间均可促进淋巴细胞由G0/G1期进入S期，且作用18h效果最明显，其G0/G1期由97.03%下降到89.99%，S期由2.58%升高到9.08%。到24h后，其诱导作用反而有些下降。因此，甜菜碱4mM作用24h促淋巴细胞增殖最为理想。4mM的甜菜碱18h促进淋巴细胞由G0/G1期进

3、入S期的作用效果最好。关键词：甜菜碱；淋巴细胞增殖；细胞周期 Effects of Betaine on Mouse Splen-lymphocytes in VitroJI yu-bin1,2, FENG xiao-yan1,2, GAO shi-yong1,2(1. Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce. Harbin 150076, China. 2. Engineering Research Center

4、of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education. Harbin 150076, China)Abstract: To investigate the effects of Betaine on splen-lymphocytes proliferation, To observe the effects of the Betaine on the lymphocyte proliferation of mouse by MTT at different concentrations and times. To observe the eff

5、ects of the Betaine on the lymphocyte proliferation cell-cycle of mouse by FCM. The result indicate that Betaine can stimulate lymphocytes proliferation at the concentrations of 0.4mM、4mM and 20mM, but 4mM is the best; Betaine can stimulate lymphocytes proliferation at the time of 24h、48h and 72h, b

6、ut 24h is the best. Betaine can change the cell-cycle distribution of lymphocytes at different times, and the best time of increasing the proportion of S-phase cells is 18h , raising from 2.58% to 9.08%. So, betaine can stimulate lymphocytes proliferation and the best concentrations is 4mM, the best

7、 time is 24h. Betaine can increasing the proportion of S-phase cells, 18h is the best.Key words: Betaine；Lymphocytes proliferation；cell-cycle； 甜菜碱是一种季氨型生物碱，又名甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸等1，化学名称为N-N-N-三甲基甘氨酸内盐2，结构简式（CN3）3N+CH2COO-，其化学结构与氨基酸、胆碱相似3。甜菜碱本身是动物体内的代谢中间产物，经大量试验证明，甜菜碱及其盐类无毒、无害、无污染4，其小鼠半数致死量（LD50）在11000mg/kg

8、，对动物无致畸、致癌、致突变作用，是公认的安全物质5，且能促进脂肪代谢，促进蛋白质的合成6。淋巴细胞（lymphocyte）是免疫系统中较重要的细胞，在免疫应答中起关键作用7，有关报道指出甜菜碱有增强机体免疫的作用。本文研究了甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用及对细胞周期的影响。1 试验材料1.1实验仪器CO2培养箱（日本三洋公司）；流式细胞仪（美国Backman-Coulter公司）；Olympus IX70倒置显微镜（Olympus公司）；电子天平（Ohaus公司）；Bio-680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；Gilson移液器（France）1.3实验药品与主要试剂甜菜碱（浙江绿成生

9、物技术有限公司）；ConA （Sigma公司）；MTT（Sigma公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；RPMI-1640（Gibco公司）；核糖核酸酶（Sigma公司）；PI（Sigma公司）1.3实验动物BALB/c小鼠：兼用，体重(20±2.0)，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，2试验方法 2.1小鼠脾淋巴细胞分离以颈椎脱臼法处死小鼠，用 75乙醇浸泡小鼠15min，沿腹腔中线剪开小鼠胸腔，取出脾脏置于培养皿中，剪去脂肪和筋膜组织，用RPMI1640培养液漂洗，用注射器芯轻轻挤压，用200目尼龙网过滤到玻璃离心管中，无菌PBS，1500 rpm离心5 min洗涤细胞两次

10、，加入0.83的氯化胺到洗过的细胞中，静置5min,以除去血红细胞，用RPMI1640培养液离心洗涤细胞两次，以除去剩余的氯化胺，将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培养瓶中，在 37，5% CO2培养箱中静止培养24h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即获得脾淋巴细胞。计数接种培养，台盼蓝染色计数，活细胞数大于95。2.2甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（1）甜菜碱最佳浓度的考察：取小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度为1.5×106个ml，100L/孔加入96孔细胞培养板,每孔加入100L不同浓度的甜菜碱，甜菜碱的最终浓度分别为0.04mM、0.4mM、4mM、20mM，同时加入促细胞有丝

11、分裂原刀豆球蛋白（ConA），终浓度为0.1×10-3mM。设空白对照孔（不加任何药物，只有细胞和培养液），同时设无细胞对照，以排除假阳性。每一浓度6个复孔。 置于37、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中培养72h后，每孔加22L新鲜配制的12mM 的MTT，继续培养4h，轻轻吸取培养液上清150L，每孔加150L DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用酶标仪于570nm波长读取各孔光密度值。（2）最佳时间的考察：方法同上，只是将甜菜碱浓度定为上述实验筛选出的最佳浓度，培养时间为12h、24h、48h、72h。2.3甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响取小鼠脾淋巴细胞，调整

12、细胞浓度为1.5×107个ml，以1ml/孔加入24孔培养板，加入甜菜碱使其终浓度为4mM，设RPMI-1640培养基为阴性对照组。于4h、6h、18h、24h收集细胞。1500转离心15min，细胞沉淀用70%乙醇悬浮，在4冰箱固定12小时以上。固定后的细胞用PBS洗两遍并悬浮，加入0.8ml PI染液（生理盐水 32.4ml；核糖核酸酶 0.5mg；Triton-x-100 0.25ml；PI 2.5mg；枸橼酸钠 50mg，加蒸馏水至50ml，4避光保存），摇均匀后于4，避光放置1小时，经300目尼龙网过滤，在流式细胞仪上计数10,000个细胞，分别测定各个时间段各期细胞含量，

13、分析细胞周期。每组均重复三次。2.5统计分析用SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析。3实验结果 3.1甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响对甜菜碱不同浓度分析表明，甜菜碱终浓度0.4mM、4mM、20mM均可促淋巴细胞增值，但终浓度4mM效果最为明显。对甜菜碱不同时间分析表明，在甜菜碱刺激24h、48h、72h后，淋巴细胞均可显著增值，但随时间的加倍，增值幅度并不明显，综合考虑，24h效果更好。因此甜菜碱4mM作用24h促淋巴细胞增殖最为理想。Table 1 Influence of Betaine on mouse splen- lymphocytes at different conce

14、ntration（±，n=6）GroupDose(mM)OD value ControlConABetaine0.1×10-30.040.44200.25±0.010.39±0.01*0.29±0.01*0.35±0.02*0.37±0.01*0.36±0.01*p<0.05 vs control , *p<0.01 vs controlTable 2 Influence of Betaine on mouse splen- lymphocytes at different times（±，n

15、=6）TimesOD valueControl ConA Betaine12h24h48h72h0.26±0.01 0.31±0.02* 0.28±0.01* 0.25±0.01 0.37±0.01* 0.35±0.01* 0.25±0.01 0.38±0.01* 0.36±0.01*0.25±0.01 0.39±0.01* 0.38±0.01*p<0.05 vs control , *p<0.01 vs control3.2甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响由

16、不同时间点淋巴细胞周期与甜菜碱作用0小时比较分析表明，甜菜碱有诱导淋巴细胞由G0/G1期进入S期的作用，且作用18h效果最明显，其G0/G1期由97.03%下降到89.99%，S期由2.58%升高到9.08%。到24h后，其诱导作用反而有些下降。（Table2）Table2 Influence of Betaine on the cell-cycle of mouse splen- lymphocytesat different times（±，n=3）TimesCell-cycle(%)G0/G1 S G2/M0h4h6h18h24h97.05±0.25 2.58

17、7;0.39 0.37±0.1496.60±0.28* 2.85±0.43* 0.55±0.1694.54±0.40* 4.83±0.28* 0.63±0.1490.23±0.36* 9.00±0.46* 0.77±0.2194.76±0.60* 4.34±0.31* 0.57±0.28*p<0.05 vs 0 h , *p<0.01 vs 0 h4讨论 本实验为小鼠脾淋巴细胞的体外实验，是在小鼠脾淋巴细胞的分离及培养成功的前提下进行的，所以如何能更好的

18、分离出小鼠脾细胞，使其存活率最大且不产生污染是本实验的关键。这里在前人工作的基础上，不断摸索，得出了取小鼠脾细胞较好的方法。淋巴细胞只有在某些活性物质刺激下才能增殖，如美洲商陆丝裂原（PWM）8、刀豆蛋白（ConA）、脂多糖（PAS）等有丝分裂原9。本实验发现甜菜碱在体外能促进小鼠脾淋巴细胞增殖。且浓度在4mM以内，随着药物浓度的增大，细胞增殖越明显，当浓度大于4mM时，细胞增殖作用反而下降。说明甜菜碱促淋巴细胞增殖作用有一定浓度限制，其最佳浓度为4mM，指导了以后实验的给药浓度。甜菜碱促淋巴细胞增殖作用在24h时效果最明显，为以后试验时间的设计提供了参考。细胞增殖是有周期性的，也就是具有细胞

19、周期10。一个细胞周期包括：G0（休止期），细胞处于休止状态；G1（DNA合成前期），完成RNA与蛋白质合成；S（DNA合成期），完成DNA合成；G2（DNA合成后期），完成RNA与蛋白质合成；M（细胞分裂期），完成 染色体装配11。流式细胞仪对细胞周期的分析主要是对单个细胞内DNA含量的分析12，通过标记物（PI）发出红色荧光的强弱可推算出G0/G1期(二倍体)，S期(超二倍体)，G2/M期(四倍体)的比例13，其敏感性和特异性均超过其它方法。通过分析可知甜菜碱有促进淋巴细胞由G0/G1期进入S期的作用，且作用18h效果最明显。说明甜菜碱促使小鼠脾淋巴细胞由G0/G1期进入S期而起

20、到促淋巴细胞增殖的作用。参考文献：1Kiene RP.Uptake of Choline and Its Conversion to Glycine Betaine by Bacteria in Estuarine WatersJ.Appl Environ Microbiol.1998 64(3):1045 -1051. 2Go EK, Jung KJ, Kim JY, et al. Betaine suppresses proinflammatory signaling during aging: the involvement of nuclear factor-kappaB via nu

21、clear factor-inducing kinase/IkappaB kinase and mitogen-activated protein kinasesJ. J Gerontol A Biol Sci Med Sci.2005,60(10):1252-64. 3Oishi H, Ebina M.Isolation of cDNA and enzymatic properties of betaine aldehyde dehydrogenase from Zoysia tenuifoliaJ.J Plant Physiol.2005, 162(10):1077-86. 4Atkins

22、on W, Elmslie J, Lever M, et al. Dietary and supplementary betaine: acute effects on plasma betaine and homocysteine concentrations under standard and postmethionine load conditions in healthy male subjectsJ.Am J Clin Nutr. 2008, 87(3):577-85.5Ji C,Kaplowitz N. Betaine decreases hyperhomocysteinemia

23、, endoplasmic reticu- lum stress, and liver injury in alcohol-fed miceJ.Gastroenterology. 2003,124(5): 1488-99.6Kim SJ,Jung YS,Kwon do Y,et al. Alleviation of acute ethanol-induced liver injury and impaired metabolomics of S-containing substances by betaine supplementationJ. Biochem Biophys Res Comm

24、un.2008, 18;368(4):893-8. 7Kitagawa H, Ohta T, Makino I, et al. Carcinomas of the ventral and dorsal pancreas exhibit different patterns of lymphatic spreadJ.Front Biosci. 2008 1;13:2728-35.8Liu S, Mizu H, Yamauchi H.Molecular response to phototoxic stress of UVB-irradiated ketoprofen through arresting cell cycle in G2/M phase and inducing apoptosisJ.Biochem Biophys Res Commun. 2007, 21;364(3):650-5.9Kurita M, Suzuki H, Kawano Y,et al. CR/periphilin is a transcriptional co-repressor involved in cell cy