冠心宁注射液对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用研究

1、    冠心宁注射液对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用研究作者：余浩，王祥，涂远超，陈苏，何传飞，李松南    作者单位：湖北省新华医院心内科，湖北 武汉 430015；华中科技大学附属协和医院心内科 【摘要】  目的：探讨冠心宁注射液对大鼠缺血再灌注心肌的影响。方法：40只SD大鼠被随机分为四组，每组10只，分别为：假手术组、梗塞对照组、冠心宁注射液低剂量组、冠心宁注射液高剂量组。采用结扎冠状动脉左前降支的方法复制急性心肌缺血再灌注模型，观察大鼠急性心肌梗塞范围、梗塞心肌组织细胞因子白细胞介素（IL）-10、肿瘤坏死

2、因子（TNF）-的水平。结果：（1）冠心宁注射液低、高剂量组心肌梗塞范围均显著小于梗塞对照组（P<0.01），两剂量组之间无显著差异（P>0.05）；（2）冠心宁注射液低、高剂量组IL-10水平高于梗塞对照组（P<0.05），低于假手术组（P<0.01）；TNF-水平低于梗塞对照组（P<0.05），高于假手术组（P<0.01），而两剂量组之间无显著差异（P均>0.05）。结论：冠心宁注射液能抑制大鼠坏死心肌TNF-的表达，促进IL-10的生成，抑制炎症反应，减少心肌梗塞范围，具有较好的心肌保护作用。【关键词】  心肌梗塞；心肌缺血；再灌注损伤

3、Protective effects of guanxinning injection on myocardial ischemiareperfusion injury in rats/YU Hao,WANG Xiang,TU Yuanchao,CHEN Su,HE Chuanfei,LI SongnanDepartment of Cardiology, Hubei Xinhua Hospital, Wuhan,Hubei, 430015,ChinaAbstract：Objective:To study the protective effect of Guanxinning injectio

4、n on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Methods:A total of 40 SD rats were randomly divided into four groups, each with 10  rats(including two rats  were used in  paintings and the other eight used in experiment  observation   from each group).Four groups we

5、re as follows: sham operation group, the infarction control group,Guanxinning injection of lowdose group, Guanxinning injection of highdose group.The model of acute myocardial ischemia rat was obtained by legating the left anterior descending coronary artery.Results:The extent of myocardial infracti

6、on of Guanxinning injection high and low dosage treated group  reduced significantly compared with that of model group (P<0.01), and two dosage treated group was not different (P>0.1).The IL-10 levels in necrotic myocardial cell after giving Guanxinning injection were higher than that in

7、the I/R group (P<0.05),and were lower than that in  sham operation group(P<0.01).While the TNF- levels in  necrotic myocardial cell after giving Guanxinning injection were lower than that in I/R group (P<0.05),and were higher in the sham operation group (P<0.01).The levels of I

8、L-10 and TNF- in necrotic myocardial cell in Guanxinning injection high,low dosage  group were not singificant difference(P>0.05).Conclusion: Guanxinning injection can reduce TNF- and increase IL-10 levels in the necrotic myocardial cell，decrease the extent of myocardial infraction， and has

9、protective effects on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Key words：Myocardial infarction;Myocardial ischemia;Reperfusion injury    近年来，随着经皮冠状动脉血管成形术、冠状动脉旁路移植术等的广泛应用于临床，急性心肌梗塞（AMI）的治疗步入了再灌注时期。心肌在较长时间缺血后，恢复供血可加重损伤，这一现象被称为心肌缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury）。冠心宁注射液由丹参、川芎等中

10、药组成1。现代药理学研究证明,丹参具有抗血小板聚集、抗血栓形成、促纤维蛋白降解、抗心肌缺血及清除自由基和抗氧化作用；川芎具有抗血小板聚集作用,并有扩张血管、增加冠脉流量、改善微循环作用。但对于冠心宁注射液能否减少心肌梗塞范围，减轻心肌缺血/再灌注损伤，尚有待研究。    1  材料与方法1.1  材料 1.1.1  实验动物 ：SD大鼠（雌雄不分），体重（200±25）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。1.1.2  实验用药 ：（1）冠心宁注射液：山西亚宝药业有限公司，生产批号：071201；

11、（2）20%氨基甲酸乙酯（乌拉坦）：上海化学试剂厂，生产批号：070521； （3）硫黄素：Amresco 公司，生产批号：070122； （4）伊文思蓝：如吉生物公司，生产批号：070223；（5）红四氮唑（TTC）： SIGMA公司，生产批号：066k06981.1.3  实验用主要试剂： （1）白介素（IL）-10试剂盒：武汉博士得生物技术公司；（2）肿瘤坏死因子（TNF）-试剂盒：武汉博士得生物技术公司 。1.1.4  实验主要仪器：（1）16道生理记录仪(MP-150,美国BIOPAC)； （2）;动物人工呼吸机(LDH-140,浙江医科大学仪器实验厂) 。1.2

12、  方法1.2.1  动物模型制备：大鼠予20%乌拉坦麻醉，仰卧位固定。分离气管并插管后，立即正压人工呼吸（呼吸频率50次min，流量20mlkg）,从左侧第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，在肺动脉圆锥左缘平左心耳根下缘2mm冠状动脉处进针，用50无损伤缝合线穿过心肌层，以备结扎冠状动脉左前降支引起缺血用。结扎冠状动脉左前降支，缺血30min后解除结扎，再灌注120min。心电监护：ST段抬高、T波高耸标志心肌缺血的存在；以抬高的ST段下降，T波逐渐恢复为再灌注成功。1.2.2  方法步骤：（1）SD大鼠被随机分为4组，每组10只。分别为：假手术组，冠脉

13、穿线而不结扎；梗塞对照组，冠脉结扎但不给药；药物干预组，分为低、高剂量组，分别给予1mlkg,3mlkg冠心宁注射液，于造模前分别以生理盐水2ml,6ml稀释后从大鼠颈静脉缓缓滴入；（2）缺血/再灌注结束后向动物心房内注入硫黄素0.20.3 ml，5min后每组取2只冠脉左前降支原位重新结扎，由心房内注入0.5g/L伊文思蓝0.5ml，待心脏充分染成蓝色后，迅速摘取心脏，用冰生理盐水冲洗后剪去心房、血管及脂肪组织，-20°C冻存10min。将心室切成约1mm厚的薄片，分别在普通日光灯下、紫外线下观察伊文思蓝、硫黄素染色形态；（3）上述观察后将薄片置入pH7.4、1.0g/L的TTC液

14、中37°C孵育10min；（4）退出实验的标准 有下列情况之一的大鼠将退出实验: 当灌注染色后,缺血质量不足心脏重的15%;结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者; 过度出血并致血压下降者; 呼吸心跳停止超过30s者。1.2.3  观察指标及测定方法：（1）心肌梗塞范围测定：每组取8只大鼠缺血/再灌注结束后摘取心脏, -20速冻后,沿心脏结扎线以下横切6片,置1%的TTC磷酸盐缓冲液中染色15min (37水浴)。肉眼观察,梗塞区呈灰白色,未梗塞区呈红色。沿坏死组织边缘分离,将梗塞心肌组织与未梗塞心肌组织分别称重,以梗塞心肌占整个心脏重量的百分比表示梗塞范围；（2）心肌组织 IL

15、-10、TNF-测定：应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测IL-10, 放免法检测血浆TNF-,均按试剂盒要求进行检测。每组取8只灌注结束后，立即将大鼠心脏剪下，冰生理盐水漂洗，切取冠脉左前降支供血的前壁全层心肌组织，称重后制成5%的匀浆液，离心取上清液，按试剂盒说明检测IL-10、TNF-的水平。1.3   统计分析计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用t检验。P<0.05为差异有显著性。    2  结  果2.1  各组梗塞范围比较冠心宁注射液对

16、大鼠心肌梗塞范围的影响 各给药组全心脏的重量与模型组比较无显著差异(P>0.05)；假手术组各动物心肌染色后未见明显梗塞区；梗塞对照组心肌梗塞区占全心脏重量的百分比为(33.08±4.87)%；冠心宁注射液低、高两个剂量组梗塞程度明显减轻,梗塞区重占全心脏的百分比与梗塞对照组比较均有显著性差异(P<0·01),。而冠心宁注射液低、高两个剂量组梗塞区占全心脏的重量比无显著差异(P>0.05)。见表1。表1  各组梗塞范围比较(略)注：与梗塞对照组比较P<0.05，P<0.01。2.2  各组细胞因子IL-10、TNF-水平比较

17、细胞因子IL-10水平：梗塞对照组明显低于假手术组（P<0.01）; 冠心宁低、高剂量组明显高于梗塞对照组（P<0.05），但均明显低于假手术组（P<0.01）；而两剂量组间无显著差异（P>0.05）。TNF-水平：梗塞对照组明显高于假手术组（P<0.01）;冠心宁低、高剂量组明显低于梗塞对照组（P<0.05）也均明显高于假手术组（P<0.01）；而两剂量组间无显著差异（P>0.05）， 见表2。表2  各组细胞因子白介素（IL）-10、肿瘤坏死因子（TNF）-水平比较(略) 注：与假手术组比较P<0.01；与梗塞对照组比较P&l

18、t;0.05。    3  讨  论本研究表明，冠心宁注射液能减少心肌缺血/再灌注损伤时心肌梗塞范围。同时，抑制TNF-的表达，促进IL-10的生成，但低、高剂量治疗组之间上述作用无显著差异，说明为非剂量依赖性，然而，冠心宁注射液治疗的最合适剂量值得探索。TNF-是一种重要的炎性细胞因子,它与心肌缺血-再灌注的损伤相关2，能激活中性粒细胞和内皮细胞,在正常的心肌组织含量很低3, 急性心肌缺血再灌注后，TNF-于数分钟由巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞大量释放4，5。过量的TNF-会导致心脏的损伤。研究表明6, 应用TNF-抗体减少血清TNF-的含量

19、会对缺血的心肌起到保护作用。IL-10是由激活的淋巴细胞,单核/巨噬细胞和肥大细胞产生的,其作用表现为对多种促炎细胞因子的合成和巨噬细胞活性的抑制7。多数研究报道IL-10作为抗炎因子发挥保护性作用。心肌的缺血再灌注与能导致心肌损伤的强烈炎症反应密切相关,而该炎症反应可导致多种细胞因子的连锁激活,其中包括TNF-的释放增多和IL-10的表达减少。褚松筠等8在实验性大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中,应用外源性IL-10干预后,再灌注结束时大鼠心肌梗塞的面积显著降低,心肌收缩功能改善。由此可见,IL-10在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要的保护作用9。动物实验表明，丹参具有扩张冠脉、增加血流量、耐缺氧、增

20、强心肌收缩力、减慢心率、改善心脏功能、抑制凝血、促进组织修复、降低血脂、抑菌等作用10。川芎具有扩张血管、增加动脉血流量、改善微循环、抑制血小板聚集等作用11。丹参与川芎在临床应用中具有协同作用，二者的复合制剂冠心宁注射液对急性心肌缺血的治疗效果更加明显。通过对本组实验的观察，冠心宁注射液能明显减少大鼠心肌梗塞范围，其机制可能主要是冠心宁注射液抑制炎症反应。本研究发现，冠心宁注射液两组治疗组大鼠坏死心肌组织中IL-10水平高于梗塞对照组（P<0.05），TNF-水平低于梗塞对照组（P<0.05），说明冠心宁注射液对缺血/再灌损伤心肌炎症反应有抑制作用，而炎症反应是心肌缺血/再灌注损

21、伤，无复流现象等的重要病理基础。【参考文献】1田政球，吴 荔.冠心宁联合西药治疗不稳定型心绞痛临床观察J.心血管康复医学杂志，2006，15(2)：184-186.2Herskowitz A, Choi S, Ansari AA.Cytokine mRNA expression in postischemic myocardiumJ.Am J pathol, 2005, 146 (2): 419.3Aker S, Belosjorow S, Konietzkal,et al.Serum but not myocardial TNF- apha concentration is increased in pacinginduced heart failure in rabbitsJ.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2003, 285 (2): 463-469.4Bellisari FI, Gallina S, DeCaterina R.Tumornecrosis factor and cardiovascular diseaseJ.Ital Heart J, 2006, 2 (6): 408-417.5Frangogiannis NG, Lindsey ML, Michael LH,et al.Resident cardi