单细胞显微切割术在霍奇金淋巴瘤中的应用

1、    单细胞显微切割术在霍奇金淋巴瘤中的应用        摘要目的:应用单细胞显微切割技术分离和研究霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)瘤细胞,并检测其是否存在人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染。方法:采用单细胞显微切割技术从HL组织切片中获得其瘤细胞Reed-Sternberg/Variant (RS/V)细胞，提取DNA后,利用PCR扩增HCMV立即早期基因片段。结果:单细胞显微切割可将RS/V细胞从

2、HL淋巴组织中独立分离出来，收集切割的瘤细胞可获得用于PCR扩增的模板DNA，在13例HL石蜡组织切片中有4例经PCR扩增出149bp的目的片段。结论:单细胞显微切割技术适用于HL瘤细胞研究;部分HL组织的RS/V细胞中存在HCMV感染。关键词显微切割； 霍奇金淋巴瘤； 巨细胞病毒感染； 聚合酶链式反应中分类号R733文献标识码A文章编号1001-7399（2000）04-0310-03Application of microdissection technique in the research of Hodgkin's lymphomaYan Qingguo, Huang Gaos

3、heng, Zhu Desheng, Wang Zhe(Dept of Pathol, Fourth Military Medical University, Xi'an710033)ABSTRACTPurposeTo isolate and study the neoplastic cells of Hodgkin's lymphoma by microdissection technique,and to make clear whether human cytomegalovirus exists in the neoplastic cells. MethodsMicro

4、dissection for getting Reed-Sternberg/Variant(RS/V) cells from sections of Hodgkin's lymphoma and PCR for amplificating fragments of immediately early gene in human cytomegalovirus were employed. ResultsRS/V cells can be separated from their surrounding cells in tissues of Hodgkin's lymphoma

5、 after microdissection,and template DNA can be extracted from the microdissected cells. Out of 13 cases of Hodgkin's lymphoma, the expected 149bp fragments of HCMV were detected by PCR in 4 cases. ConclusionMicrodissection technique can be used in analysis of neoplastic cells in Hodgkin's ly

6、mphoma. Human cytomegalovirus infection exists in RS/V cells in some cases of Hodgkin's lymphoma.KEY WORDSmicrodissection; Hodgkin's lymphoma; cytomegalovirus infections; polymerase chain reaction霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma,HL）是恶性淋巴瘤的一个独特类型,其肿瘤异质性表现明显,瘤组织成分多样,特征性的瘤细胞(R-S细胞及其变异型)占细胞成分的1%以下,

7、且呈散在性分布,这为对其瘤细胞进行分析带来一定困难,特别是在常规PCR检测中,从组织中提取的DNA或RNA模板包含了来自R-S细胞及其变异型瘤细胞和来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞等多种非瘤细胞成分,其结果不能反应肿瘤细胞的状况。近年来的研究表明,单细胞显微切割技术可特异地将欲研究的目的细胞从其它细胞中分离出来用于进一步分析。该方法特异性强, 并可将形态学与分子生物学方法很好地结合起来,特别适于肿瘤异质性的相关研究,其应用日益广泛1。我们应用此技术结合PCR方法在HL瘤细胞中进行了人巨细胞病毒的检测。1材料与方法1.1材料1.1.1标本13例HL患者淋巴结来自我校3个附

8、属医院病理科，淋巴结经常规福尔马林固定、石蜡包埋，HE染色并经病理诊断证实。其中混合细胞型8例，结节硬化型4例，淋巴细胞消减型1例。1.1.2主要设备日本Narishige液压显微操作系统（Narishige Co,LTD），日本Olympus普通光学显微镜，PE-2400扩增仪购自美国PE公司。1.1.3主要试剂Taq DNA Polymerase为加拿大Sangon公司产品，矿物油及蛋白酶K为Sigma公司产品。1.1.4引物PCR引物根据HCMV立即早期第四外显子设计，上游引物：5'-GTACTGGGCAAAGACCTTCA-3'；下游引物：5'-TAAGTGAG

9、TTCTGTCGGGTG-3'。扩增片段长度为149 bp。1.2方法1.2.1待切割组织片的制备经10%福尔马林固定、石蜡包埋的组织块依病理学常规方法制备7 m连续切片，贴于载玻片置烤片机上70烤2 h，依下列步骤处理后不封片用于显微切割：二甲苯浸泡2次，5min/次，100%、95%、80%、70%乙醇及去离子水各2 min，10滴苏木精染液1 min后置于去离子水洗，5滴返蓝液（0.2% Na2CO3,0.04% Li2CO3）5 min后去离子水洗；10滴伊红染液1 min后去离子水洗；甘油缓冲液（2.5% glycerol; 0.05 mol/L Tris/HCl,pH 8.

10、9;2 mmol/L EDTA;1 mmol/L NaCl）2 min后冷风机吹干。1.2.2显微切割根据Moskaluk等2介绍的方法并作部分改进，将直径0.5 mm的空心玻璃微管先用显微操纵系统中的拉针器制成用于切割细胞和吸取细胞两种类型尖端大小不同的玻璃针，切割用针尖端约1 m，吸取用针尖端约10 m；将与显微操纵机械手通过液压相连的持针器固定于显微镜操作平台，再将玻璃针固定于持针器，玻璃针尾部与充满矿物油的摸针器相连。在显微镜下找到待切割细胞的视野后，滴加去离子水，在x、y、z轴3个方向上精巧控制显微操纵机械手，用切割针将切割的细胞与周围细胞分割开，使其游离聚集，再用吸取针吸取并吹打入

11、EP管中。1.2.3DNA提取将含切割的RS/V细胞的EP管12.000 g离心，每10个细胞加入5 l TK消化液（0.5% Tween 20,0.02%蛋白酶K），Vortex混匀后短暂离心，置55水浴过夜；再置100烤箱中烤10 min；Vortex混匀后短暂离心供PCR用。1.2.4PCR扩增及产物鉴定PCR反应总体积为50 l，循环参数为：95 5 min;94 1 min,52.5 1.5 min,72 1.5 min,35个循环；72延伸10 min。在PCR反应中设立用去离子水替代扩增模板的阴性对照及用人HCMV立即早期基因为扩增模板的阳性对照。扩增产物以2%琼脂糖电泳检测。2

12、结果通过显微操纵系统精细控制下的单细胞显微切割，可将R-S及其变异型细胞同周围的非瘤细胞精确分离。13显示了单个R-S细胞变异型陷窝细胞在显微切割前后的状况。在13例福尔马林固定石蜡包埋的HL组织切片中，用显微切割技术每例获得1530个不等的单个R-S或其变异型细胞用于PCR扩增，所收集细胞经采用蛋白酶K消化，100 10 min灭活蛋白酶K后获得的DNA模板行PCR扩增，2%琼脂糖电泳检测，结果在13例中有4例扩增出预期的149 bp片段，其中3例为混合细胞型，1例为结节硬化型，阳性对照和阴性对照结果明确（4）。3讨论显微切割技术在生物学研究中的应用经历了显微组织切割、细胞群切割、单个细胞切

13、割、单细胞内组分切割、染色体切割等阶段，随着技术方法的不断改进，显微切割的区域不断变小，而应用的领域则不断扩大1。目前应用最为广泛的是旨在分离单个细胞的单细胞显微切割，该技术具有其独特的优势，它一方面可在细胞层次上使研究定位清楚，排除周围其它细胞在分析中的干扰，另一方面又可与分子克隆、PCR、免疫组织化学等多种分子生物学和免疫学的研究方法相结合，而且研究取材广泛，培养细胞、常规制备的染色体、石蜡切片、冷冻切片、细胞铺片等均可采用，因此其应用十分广泛。目前在新基因的发现、基因突变研究、染色体畸变、细胞局部病变病因学研究等多种领域均有研究应用3,4。1陷窝细胞（）显微切割前。×4002陷

14、窝细胞（）显微切割中。×4003显微切割后陷窝细胞被去除（）。×4004RS/V细胞显微切割后HCMV的PCR检测结果1：123 bp 梯度Marker; 2:阳性对照；3：阴性对照； 416 ：13例检测样本，其中4、5、8、9扩增出149 bp HCMV片段单细胞显微切割的具体方式有多种,各具特色,不同实验室可根据各自条件进行选择。Lee等1所报道的采用30G1/2注射用针替代需要专用拉丝设备制作的玻璃微针,再利用普通光学显微镜的微调旋钮控制切割单个细胞,此方法简单易行、低耗,尤其适合基层，但切割精度的控制较低；采用液压式显微操纵系统配合倒置显微镜进行显微切割是很多实验

15、室常用的方法2。本研究即根据此方法进行适当改进而来的，它可以利用一些实验室原有的显微操作装置,但不能自动化,要收集较大量细胞时耗时长；激光捕获式显微切割是目前最为先进的方法,它快速方便,可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的细胞,自动化程度高,但这需要昂贵的专用设备3。单细胞显微切割用于基因组DNA分析所需的单个细胞数，依研究目的、切割组织的固定方式而有差异，Dietmaier等5比较了用流式细胞仪分选细胞和用显微切割从冰冻切片和石蜡切片上切割单个细胞用于突变分析所需的最少细胞数，结果冰冻切片与流式细胞仪相同，至少需要10个细胞，而石蜡切片一般需要30个细胞。因不同组织类型的HL瘤细胞数差异较

16、大，本研究中每例获得了1530个不等的单个瘤细胞用于PCR分析，其中4例PCR阳性所获细胞分别是18、25、26、28个；此外，切片厚度也是影响单细胞显微切割分析的一个因素，在不影响形态观察的前提下，作为显微切割的组织切片越厚越好，本研究中我们在7 m的连续石蜡切片上进行单细胞切割，获取满意结果。在HL的病因研究中，从瘤细胞中直接检测出致病因子是十分重要的,最近我室利用PCR和原位杂交的方法直接检测到在HL淋巴组织中存在HCMV的感染6。为进一步明确瘤细胞中是否存在HCMV的感染,我们又采用单细胞显微切割技术进行了深入分析。从结果看,采用液压式显微操纵系统可以方便地将R-S及其变异型细胞与其它

17、非瘤细胞分离,切割下来的R-S及其变异型细胞用于PCR分析,在13例中有4例扩增出预期的149 bp片段，其结果表明在HL瘤细胞中确实存在HCMV感染。综上所述,单细胞显微切割技术可从多种细胞类型的组织中获得单一的细胞类型,用于针对该型细胞的特异性分子生物学分析,从而将形态学与分子生物学相结合,已成为对肿瘤细胞进行研究的一个重要工具。基金项目：全军医药卫生科研基金（No 98D046）和陕西省自然科学基金(No 98M38)资助课题作者简介：闫庆国，男，31岁，博士。研究方向：淋巴造血组织肿瘤闫庆国(第四军医大学病理学教研室)黄高?(第四军医大学病理学教研室)朱德生(实验动物研究中心， 西安7

18、10033)王哲(第四军医大学病理学教研室)参考文献1，Lee JY,Dong SM,Kim SY et al. A simple,precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue sections. Virchows Arch, 1998;433(4):3053092，Moskaluk CA,Kern SE. Microdissection and polymerase chain reaction amplification of genomic DNA from histological tissu