尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞内游离钙浓度的影响

1、    尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞内游离钙浓度的影响 郑志明作者单位：山东大学附属省立医院神经外科， 济南 250021【摘要】目的 研究尼莫地平对脑挫裂伤后神经细胞胞浆内游离钙离子浓度变化的影响。方法 将Wistar大鼠随机分为对照组、创伤组、治疗组;创伤组按照Feeney自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型，治疗组在外伤后开始静脉滴注尼莫地平。分别对脑挫裂伤后0.5、1、3、6、12、24、48?h各时相点细胞内游离钙离子浓度和细胞凋亡率进行检测。对不同时相的创伤组、治疗组和对照组进行比较分析。结果 脑挫裂伤后大脑皮层神经细胞内游离钙离

2、子浓度迅速升高，0.5?h时为正常值的4倍，24?h时达到高峰，48?h时降低明显，但仍然维持在比较高的水平。应用尼莫地平治疗后，钙离子浓度显著降低，6?h时降至接近正常水平。脑挫裂伤后神经细胞凋亡率和胞内游离钙离子浓度存在相关性。结论 脑挫裂伤后神经细胞胞浆内钙离子浓度升高，导致钙超载并引起细胞凋亡。早期应用尼莫地平能抑制钙超载，抑制细胞凋亡，对神经细胞具有极强的保护作用。【关键词】 细胞凋亡 钙 脑损伤 尼莫地平To study the effects of nimodipine on intracellular free Ca2+ concentration in rat neurocy

3、tes following cerebral contusions. Methods Wistar rats were randomly divided into three groups: the control group, the trauma group and the treatment group. The cerebral contusion models were established based on the Feeney method and nimodipine was immediately administered after cerebral contusions

4、. The related parameters at different times after cerebral contusion were detected. Intracellular free Ca2+ concentration and apoptosis rate were determined by flow cytometry. Results After cerebral contusion, intracellular free Ca2+ concentration was increased and reached a peak at 24?h and then gr

5、adually decreased, but it still maintained a high level at 48?h, while nimodipine made the intracellular free Ca2+ concentration remarkably decrease and the Ca2+ level was decreased to the normal level at 6h (94.85±15.63?nmol/L). Conclusion Intracellular free Ca2+ concentration is related to ap

6、optosis rate. Nimodipine can decrease the Ca2+ levels and has some protective role against cerebral contusion.Key words： Apoptosis; Calcium; Brain injuries;Nimodipine       近年来一系列的脑外伤动物模型及人脑组织标本的研究证实，细胞凋亡在颅脑损伤后的病理生理演变中有重要的生物学效应。目前认为，细胞内游离钙升高可引起其凋亡12。钙超载影响神经细胞的结构和功能,会促发和

7、加重继发性脑损伤,导致神经细胞出现凋亡甚至死亡。尼莫地平为临床上常用钙通道阻滞剂,已有实验证实对脑缺血缺氧引起的脑损伤具有保护作用3。本研究旨在明确脑挫裂伤后神经细胞胞内钙离子浓度是否升高，及升高钙离子和细胞凋亡有无相关性，同时观察尼莫地平对脑挫裂伤后细胞内游离钙离子浓度和细胞凋亡率的影响，为其临床应用提供实验依据。1 材料与方法1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，体质量320350?g，由山东大学实验动物中心提供;胎牛血清、胰蛋白酶购自杭州四季青公司;Fluo3/AM和Annexin VFITC/PI试剂盒购自美国Sigma公司;尼莫地平由山东新华制药股份有限公司提供;F3010荧光检测

8、仪系日立公司生产。1.2 方法1.2.1 动物分组 随机将健康雄性Wistar大鼠102只分为对照组(6只)、创伤组(48只)、治疗组(48只)。对照组只给予颅骨开窗，不致伤;创伤组给予打击制作外伤模型;治疗组外伤后给予尾静脉滴注尼莫地平，首剂5?g/kg,20?min内静脉注入,维持量0.5?g/(kgmin)。其中后两组又分为伤后0.5、1、3、6、8、12、24、48?h 8个时相组,每组6只大鼠。1.2.2 脑挫裂伤模型的建立 按照Feeney4自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型。2%戊巴比妥钠50?mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠，俯卧固定在脑立体定向仪上，75%无水酒精消

9、毒，切开头皮，分离骨膜，前囟后3.0?mm向左旁开矢状缝3.0?mm为中心作直径为5mm的圆形骨窗，保持硬膜完整不受损伤。以40?g砝码于25?cm高处沿套管下落，撞击置于致伤底座(直径3.5?mm，最大下陷距离3.0?mm)，造成左顶部局限性脑挫裂伤，致伤力为1?000?g/cm。用骨腊封闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂养。对照组仅作头皮切口，颅骨开窗，不致脑损伤，于相应时相点处死动物。1.2.3 细胞悬液的制备 无菌条件下快速断头取脑，剥离出大脑皮层,显微镜下剥除软脑膜、血管，Dhanks液冲洗2遍，用眼科剪将其剪碎成匀浆状。加入0.125%胰蛋白酶， 37?CO2培养箱内消化15?min，加入

10、含200?mL/L胎牛血清的DMEM培养液,室温终止消化15?min。用移液管轻轻吹打，将细胞悬浊液用200目铜网过滤。1?000?r/min，离心10?min，弃上清液，收集沉淀，Dhanks液冲洗2遍。台盼蓝染色计算细胞存活率，确认活细胞在90%以上，并对细胞计数。1.2.4 神经细胞内钙离子浓度的测定 在制备好的细胞悬液中加入flour3/Am(终浓度5?mol浓度)37?孵育45?min。加入100?L含20%Triton X100和20?mmol/L CaCl2溶液，测得Fmax，再加200?mmol/L EGTA(pH7.0)100?L，测得Fmin。日立F3010荧光检测仪检测F

11、、Fmin和Fmax。细胞内Ca2+浓度按下式计算：Ca2+浓度=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)。式中Kd是Ca2+结合Fluo3/AM的解离常数，Kd=316nmol/L，F为测定荧光信号。1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 取6×105个细胞，0.3%胰酶消化。1?000?r/min，4?，离心7?min，弃上清液，细胞用PBS冲洗2次，悬浮于200?L binding buffer，加入10?L Annexin V/FITC，轻轻混匀，室温、避光孵育15?min，加入5?L PI液，300?L binding buffer混匀后用流式细胞仪分析，区分活细胞

12、、早、中、晚期凋亡及坏死细胞。1.3 统计学处理 全部实验数据均采用SPSS 11.0医学统计学软件进行分析，以2 结 果2.1 脑挫裂伤后神经细胞胞内钙离子浓度和细胞凋亡率的测定 脑挫裂伤后大脑皮层神经细胞内Ca2+浓度迅速升高，0.5?h时约为正常对照组的4倍，随着时间的延长，Ca2+浓度逐渐升高，24?h时达到高峰，48?h时降低明显，但仍然维持在较高水平，见图1。不同时相创伤组均较对照组细胞内Ca2+浓度显著性升高(P<0.01)。细胞凋亡率在脑挫裂伤后0.512?h无明显变化，24?h以后显著增加(P<0.01)，见表1。48?h时对照组与创伤组神经细胞胞内Ca2+浓度变

13、化经拟合后变化趋势的对比3 讨 论脑外伤后神经细胞会发生一系列的内分泌、核酸代谢变化，导致迟发生神经细胞凋亡。细胞内Ca2+浓度的升高可激活某些蛋白酶、磷脂酶和内源性核酸酶，这些酶的激活可诱发细胞凋亡5。已有研究67证实，细胞内钙离子浓度的升高的确参与了细胞凋亡的早期决定阶段。McConkey等8认为钙离子通过两条途径诱导细胞凋亡:胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流促使胞浆Ca2+浓度持续升高启动细胞凋亡;钙离子的释放打破了钙稳态，启动细胞凋亡效应系统和细胞基质接触诱发细胞凋亡。本研究表明，大鼠脑挫裂伤后Ca2+浓度的变化具有时间依赖性。刘石林等9在大鼠脑挫伤后脑不同部位组织内钙含量的变化研

14、究中同样发现脑挫伤后脑细胞内游离钙明显增加，各脑区细胞内钙含量都明显升高。本研究发现细胞凋亡率在脑挫裂伤后0.512?h无明显变化，24?h以后出现显著增加。吴思荣等10在人脑挫裂伤后神经细胞凋亡的研究中发现颅脑损伤患者伤后4?h即发生神经细胞凋亡，高峰在2372?h，且神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞均可发生凋亡。本研究同样观察到在大鼠脑挫裂伤24?h后凋亡率显著升高。尼莫地平作为电压门控钙通道阻滞剂,在蛛网膜下腔出血等疾病中的治疗作用已得到肯定,但对其在脑缺氧缺血损伤中的作用,不同的实验有不同的结论。在挫裂伤组织内谷氨酸、甘氨酸等增加,过度激活N甲基D天门冬氨酸(NmethyDaspar

15、tate, NMDA)受体,引起大量钙内流,导致钙超载。而尼莫地平可与NMDA受体结合,阻止过度的钙内流，抑制钙超载,从而阻断其介导的神经毒性作用。本实验应用尼莫地平治疗后，各组钙离子浓度都显著降低，8?h时降至接近正常水平，表明尼莫地平的应用最佳时机在早期。应用尼莫地平后细胞凋亡率0.512?h无明显变化，24?h以后凋亡率减少，48?h时减少最明显。说明细胞凋亡具有时间依赖性，随着伤后时间的延长，凋亡率逐渐增加。邹吉敏等11应用原位末端标记法观察实验组海马神经细胞凋亡的情况，发现大鼠脑挫裂伤后24?h海马区神经细胞开始出现凋亡阳性细胞,72?h、120?h逐渐增多,168?h达到高峰,24

16、0?h开始下降，并且大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡与时间有关。凋亡时相点的变化规律可为临床及时采取有效的治疗措施提供可靠的理论依据。本研究发现，尼莫地平明显地抑制了脑挫裂伤后胞浆内Ca2+浓度和细胞的凋亡率，推测其通过抑制NMDA受体，抑制半胱天冬酶(caspase酶)的表达，抑制钙调蛋白(calmodulin, CaM)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、需钙蛋白酶(calpain)等对神经细胞产生保护作用，具体的作用机制还有待进一步阐明。本研究发现，脑挫裂伤后胞内钙离子浓度和细胞凋亡率具有相关性(r=0.79，P<0.05)。说明当钙离子达到一定浓度后才启动一

17、系列病理生理机制损伤神经细胞，诱导细胞的凋亡，胞浆内高浓度钙离子的持续存在参与了细胞凋亡过程，但对于胞浆内钙离子浓度的增高是凋亡的原因还是结果尚不清楚。陈康宁12在大鼠脑缺血再灌流中钙与神经元凋亡关系的研究中发现，脑缺血再灌流后细胞内Ca2+浓度不断增加，伴有神经元凋亡的不断增加，并指出脑缺血导致的钙超载参与了神经元的凋亡。但目前关于钙离子与细胞凋亡的结论仍然存在着分歧和矛盾，其原因可能是研究所选用的细胞类型和实验方法不同。本研究通过测量48?h内胞浆钙离子浓度的变化以及通过观察钙离子通道阻滞剂尼莫地平对凋亡的影响，证实脑挫裂伤神经细胞胞浆内钙离子浓度明显升高，胞内持续的钙超载参与了神经细胞的

18、凋亡过程，神经细胞胞浆内钙离子浓度和凋亡率具有时间依赖性，早期应用尼莫地平能够有效的抑制钙离子内流、减少细胞凋亡而发挥神经保护作用。随着有关创伤性神经细胞凋亡研究的深入，针对凋亡的治疗可作为创伤性颅脑损伤后治疗措施之一。【参考文献】1 Salvesen G S, Dixit V M. Caspases: Intracellular signaling by proteolysisJ.Cell, 1997, 91(4):443446.2 Masahiko K, Takashi N, Masatoshi M, et al. Caspases cleave the aminoterminal cal

19、pain inhibitory unit of calpastatin during apoptosis in human jurkat T cellJ. Biochem, 2000, 127(2):297305.3 沈惠青,樊寻梅,钱素云,等.钙通道阻滞剂对缺血再灌注兔脑皮层 NO 和含水量及细胞内游离钙的影响J.中华儿科杂志,2002,40(10):608611.4 Feeney D M, Boyeson M G, Linn R T, et al. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contu

20、sions in the ratJ. Brain Res, 1981, 211(1):6777.5 McConkey D J, Orrenius S. Signal transduction pathways in apoptosis J.Stem Cells, 1996, 14(6):619631.6 郭静,蒲永梅,张东才.钙离子信号与细胞凋亡J.生物物理学报,2005,21(1):118.7 Jayaraman T, Marks A R. Calcincurin is downstream of theinositol 1,4,5trisphosphate receptor in the

21、apoptotic and cell growth pathways J. Biol Chem, 2000, 275(9):64176420.8 McConkey D J, Nicotera P, Orrenius S. Signalling and chromatin fragmentation in thymocyte apoptosisJ. Immunol Rev, 1994, 142(1):343363.9 吴思荣,惠国桢,王之敏,等.人脑挫裂伤后神经细胞凋亡及其与caspase3基因表达的关系J.中华创伤杂志,2006,22(7):493497.10 Liu S L, Zhao L. Changes of the contents of cerebral calcium in different areas after cerebral contusion in ratsJ. Chin J Clin