大鼠内淋巴囊的增殖细胞

1、    大鼠内淋巴囊的增殖细胞        摘要目的：了解大鼠内淋巴囊的细胞增殖状态。方法：选用10只健康成年S-D大鼠，腹腔注射5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)后，取颞骨作组织学处理，用抗BrdUrd单克隆抗体，通过免疫组织化学技术，观察内淋巴囊S期细胞的定位与分布。结果：在内淋巴囊上皮、上皮下区域和囊腔内存在着散在的BrdUrd+细胞，它们多位于内淋巴囊的中间部；耳蜗未发现阳性细胞。结论：大鼠内淋巴囊具有细胞增殖功能，可能是内耳具有细胞更新功能的重要部位。关键

2、词内淋巴囊细胞增殖5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷免疫组织化学技术 The proliferating cells in the rat endolymphatic sacHUANG Xiao-wenXIAO Hong-junWANG Ji-baoHUANG Xiang(Department of Otolaryngology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022)AbstractObjective:To study the cellular proliferating activity of the endolymphatic

3、sac.Method:10 healthy adult S-D rats were used for the experiment.After adminstration of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdUrd) intraperitoneally,the rats were sacrificed and the temporal bones were removed,then the decalcified samples examined immunohistochemically by using monoclonal antibodies against B

4、rdUrd.Result:Scattered BrdUrd+ cells were detected within the endolymrhatic sac (ES) whereas labelled cells were not fonnd in the cochlea.Conclusion:Possessing a low rat of mitotic activity,the ES may be an important the sole site for the cell-renewing in the inner ear.Key wordsEndolymphatic sacCell

5、ular proliferationBromodeoxyuridineImmunohistochemitry大量研究表明，内淋巴囊在保持内耳内环境稳定的过程中起重要作用，研究反映其细胞更新和生物学活性的细胞增殖活动具有重要意义。为了解内淋巴囊的细胞增殖状态，本研究应用细胞增殖标记和免疫组织化学技术，观察正常大鼠内淋巴囊的S期细胞的分布与定位，报告如下。1材料与方法1.1材料主要试剂：5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)(美国Sigma公司)，抗BrdUrd单克隆抗体(美国Sigma公司)，链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德公司)。实验动物：选用健康成年、发

6、育正常之S-D大鼠(由同济医科大学实验动物学部提供)15只，体重200220 g，雌雄不限。1.2实验方法1.2.1BrdUrd的活体引入和组织学处理：10只大鼠腹腔注射BrdUrd溶液(50 mg/kg)，1 h后水合氯醛腹腔注射(300 mg/kg)全麻动物，耳后下切口打开听泡，在手术显微镜(德国CARLZEISS)下，于蜗尖刺小孔后，经前庭窗和蜗窗缓慢灌注4%多聚甲醛，作活体迷路内固定(双耳手术)；然后断头处死动物，立即连同部分枕骨取出双侧颞骨，置相同固定液中固定24 h；再将标本置10%EDTA-Na2溶液23周充分脱钙，OCT包埋，用恒冷箱冰冻切片机(德国CRYOCUT1800型)，

7、垂直于颞骨颅面、平行于耳蜗长轴作冰冻切片，取耳蜗和内淋巴囊切片干燥冻存备检。取脾组织作为阳性对照。另5只动物不注射BrdUrd溶液，同法处理双侧颞骨作为阴性对照。1.2.2免疫组织化学染色：采用SABC法并参照文献1,2介绍的方法行免疫组织化学染色，主要步骤如下：室温下将切片置3%过氧化氢甲醛溶液中10 min，以封闭内源性过氧化物酶活性；以4N盐酸作用25 min，使DNA双螺旋结构变性，暴露出BrdUrd；以冷硼酸缓冲液中和切片后，用0.01%蛋白酶作用5 min，以提高抗体的通透性；10%正常羊血清封闭切片30 min；小鼠抗BrdUrd单克隆抗体(11 000)(空白对照片以PBS代替

8、一抗)孵育切片12 h(37)；生物素化羊抗鼠IgG(二抗)和SABC孵育切片各30 min；DAB溶液显色35 min，蒸馏水终止反应，脱水后以中性树胶封片。光镜观察，核呈棕褐色者为阳性细胞(即S期细胞)。2结果在实验动物内淋巴囊的囊腔、上皮层内和上皮下存在着散在的BrdUrd+细胞，其数量1至数个不等，主要出现在内淋巴囊的中间部(1，2)。从细胞核的形态判断，这些增殖细胞可能主要是上皮细胞和成纤维细胞。内淋巴囊周围的骨髓中也可见到大量的BrdUrd+细胞。在耳蜗未发现阳性细胞。1大鼠内淋巴囊囊腔和上皮层可见BrdUrd+细胞()SABC染色×4002大鼠内淋巴囊上皮层、上皮下和囊

9、周组织中可见BrdUrd+细胞()SABC染色×400在实验动物脾组织中可见到较多BrdUrd+细胞。未注射BrdUrd溶液的对照动物内耳各部均无阳性染色。空白对照切片未显示任何棕褐色着色。3讨论根据细胞增殖理论，细胞分裂周期分为G1、S、G2和M期四个阶段，其中，S期(即DNA合成期)为其必经过程和重要标志。在活体引入合成DNA的示踪性前体物质，使被增殖细胞摄取，然后通过现代实验技术，可显示S期细胞的存在，从而可了解组织的细胞增殖状态。BrdUrd为胸腺嘧啶核苷的类似物(analogue)，组织和细胞中无内源性BrdUrd存在。BrdUrd被引入体内后能代替胸苷，由处于细胞增殖周期

10、中的S期细胞特异性地摄入其细胞核。用抗BrdUrd单克隆抗体进行免疫组织化学检测，可特异性显示BrdUrd阳性标记细胞，即S期细胞在组织中的定位与分布1。有研究证实，BrdUrd标记结合免疫组织化学技术，和氚标胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)放射自显影技术，两种方法的观察结果十分相似，且前者具有无放射性污染、省时、操作简单和高立体分辨力等优点2，3。笔者曾应用该方法成功地显示出鸡S期前庭感觉上皮细胞3。本研究再次应用此技术观察了大鼠内淋巴囊的细胞增殖活性。内淋巴囊是内耳的重要组成部分，其上皮具有高度的代谢活性。通过对内淋巴的吸收和对外源性物质的处理，内淋巴囊维持着适宜内耳神经系统功能的最佳内环境2

11、。本研究应用细胞增殖标记和免疫组织化学技术，发现内淋巴囊存在散在的S期细胞，而在耳蜗没有发现这种细胞，提示大鼠内淋巴囊具有弱的细胞增殖功能，内淋巴囊可能是内耳具有细胞更新功能的重要部位。从上皮层和囊周组织中阳性细胞的细胞核形态来看，内淋巴囊增殖细胞可能主要是上皮细胞和成纤维细胞，其意义有待研究。本研究显示，S期细胞多出现在内淋巴囊的中间部，与Takahashi等2对豚鼠内淋巴囊细胞增殖的研究结果相似，表明中间部可能是内淋巴囊代谢最活跃的部位。内淋巴囊囊腔中的漂浮细胞多为来源于外周循环的吞噬细胞，它们中间出现S期细胞，说明这类细胞也可能在内淋巴囊进行增殖。 黄孝文（同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科武汉，430022）肖红俊（同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科武汉，430022）汪吉宝（同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科武汉，430022）黄翔（同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科武汉，430022）参考文献1，Sugihara H,Hattorl T,Fukuda M.Immunohistochemic-al detection of bromodeoxyuridine in formalin-fixed tis-sues.Histochemistry,1986,85:193197