山仙颗粒对荷瘤小鼠免疫功能影响的实验研究

1、山仙颗粒对荷瘤小鼠免疫功能影响的实验研究        【摘要】  目的观察山仙颗粒对荷瘤小鼠免疫系统的影响。方法纯系BALB/c小鼠30只，用U14瘤细胞荷瘤建立动物模型，随机平均分为3组：山仙颗粒组、环磷酰胺治疗组、生理盐水对照组。观察山仙颗粒对荷瘤小鼠NK细胞活性、淋巴细胞转化率、TNF-等免疫指标的影响。结果山仙颗粒能够显著提高治疗组小鼠的NK细胞活性、淋巴细胞转化率和血清中TNF-，IL-2的含量。结论山仙颗粒能够显著提高荷瘤小鼠免疫系统的活性。 【关键词】  山仙颗粒 小鼠肿瘤 免疫

2、Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Shanxian Granule on immune system in tumor-bearing mice.MethodsMMT method was used to estimate cell toxic action of Shanxian Granule.After the animal model of mouse bearing tumors was established, we observed their life spans,NK cell activity, tansformation

3、 efficiency of lymhocytic cell and the content of TNF-.ResultsShanxian Granule could significantly increase the NK cell activity and transformation efficiency of lymphocytic cell, elevate the contents of TNF-, IL-2 in tumorbearing mice.ConclusionShanxian Granule can enhance the activity of immune sy

4、stem in tumor-bearing mice.Key words：Shanxian   Granule;  Tumor;  Immunity     正气亏虚,血行淤滞是肿瘤发生与转移的基本病机。癌症患者常常免疫功能低下，加之放、化疗对全身免疫系统的损伤，患者血中吞噬细胞的活性与吞噬杀伤作用均有不同程度降低，此即中医所说的正气亏虚。由于免疫功能低下，免疫细胞难以识别和杀灭存在于血液循环中的具有转移能力的癌细胞而使癌细胞扩散，故气虚血淤是肿瘤发生与转移的主要病机，这也是癌症晚期患者最常见的证型。笔者多年的临床经验,潜心

5、研究,研制出补气活血之山仙颗粒,临床观察有防止肿瘤复发与转移作用。经动物实验证实1，2,山仙颗粒能分别从提高红细胞免疫、抑制IV型胶原酶表达、提高吞噬细胞功能、抑制肿瘤血管生成等方面对抗癌细胞侵袭与转移。为深入探讨其抗癌转移机理,本实验对山仙颗粒对荷瘤小鼠肿瘤免疫系统的影响做了进一步研究。现报道如下。1  器材与方法1.1  材料1.1.1  动物纯系BALB/a小鼠，体重1822 g,67周龄，雌雄各半。1.1.2  山仙颗粒山仙颗粒由陕西中医学院附属制剂中心提供，每10 g山仙颗粒相当于11.5 g生药，用生理盐水配制成1.2 g/ml的混悬液待用。

6、1.1.3  瘤株U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞)、YAC-I（小鼠淋巴瘤细胞）购自陕西省中医研究院动物中心。1.1.4  试剂与仪器RPMI-1640；Gibco 刀豆蛋白A（ConA）；sigma 产四甲基偶唑蓝（MTT）；Flu-ka产PCH-100电脑CO2孵育培养箱；TNF-，IL-2试剂盒，上海森雄科技实业有限公司产品；奥地利产SUTSPECTRA2酶标仪。1.2  方法取U14瘤株生长最佳状态的传代细胞，按细胞数1×106/ml，0.2 ml/小鼠腹腔注射，24 h后随机分组。山仙颗粒组0.4  ml/d灌胃，1次/d，连续7 d；

7、生理盐水（NS）组用无菌NS，途径、剂量、方法、次数同山仙颗粒组；环磷酰胺（CY）组用环磷酰胺0.4 mg/ml，途径、剂量、方法、次数同山仙颗粒组。于接种瘤株后第12天各组小鼠分别摘除眼球取血，之后再脱颈处死取脾进行下一次实验。1.2.1  NK细胞杀伤活性的测定小鼠脱颈处死后无菌取脾，制成单个脾细胞，用无菌三蒸水休克红细胞30 s，迅速加入等量的1.7%无菌盐水恢复等渗，台朌蓝拒染计数活细胞在95%以上，与YAC-1一起加入96孔培养板（效靶比201），各设3个复孔，MTT法检测NK细胞活性。NK细胞活性（%）=靶细胞对照孔A值 （实验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞对照孔A值&

8、#215;100%。1.2.2  淋巴细胞增殖反应的测定  按上述方法制备脾细胞，浓度为5×106/ml,加入96孔培养板，每孔200µl，实验孔每孔再加50µl/mlConA20µl，对照孔加培养液20µl,置37 CO2孵育培养箱中培养68 h，离心取上清100µl MTT测A值，淋巴细胞增殖率。淋巴细胞增殖率（%）=实验孔A值 /对照孔A值×100%1.2.3  荷瘤小鼠血清TNF-含量测定用TNF- ELISA试剂盒，采用双夹心酶联免疫检测法，=450 nm，根据标准A值绘制曲线，从标准

9、曲线上查出待检标本的TNF-含量。1.2.4  荷瘤小鼠血清IL-2含量测定用IL-2ELISA 试剂盒，采用双夹心酶联免疫检测法，=450 nm,根据标准A值 绘制曲线，从标准曲线上查出待检标本的IL-2含量。1.3  统计方法两两比较，采用方差分析中的SND-q检验，结果以±s表示。1         2  结果2.1  山仙颗粒腹水型荷瘤小鼠，NK细胞活性及淋巴细胞增殖率的影响结果见表1。    结果表明山仙颗粒组荷瘤小鼠NK细胞

10、活性及淋巴细胞增殖率显著高于NS组及CY组(P<0.01),CY组NK细胞活性及淋巴细胞增殖率显著低于NS组（P<0.05）。2.2  山仙颗粒对腹水型荷瘤小鼠血清中TNF-，IL-2含量的影响结果见表2。表1  山仙颗粒腹水型荷瘤小鼠，NK细胞活性及淋巴细胞增殖率的影响（略）表2  山仙颗粒腹水型荷瘤小鼠血清中TNF-，IL-2含量的影响（略）结果表明山仙颗粒组荷瘤小鼠血清中TNF-，IL-2含量显著高于NS组及CY组，CY组小鼠血清中TNF-，IL-2含量显著低于NS组（P<0.05）。3  讨论   

11、 肿瘤是严重危害人类生命的疾病之一，其死亡率居高不下，为了与肿瘤作斗争，各国家进行了长期不懈的努力。近年来，中药抗肿瘤的研究日益得到人们的重视，并取得了一定的成果。山仙颗粒作为有效的抗癌制剂，已被广泛应用于临床，本实验探讨其对荷瘤小鼠免疫系统的影响。3.1  实验表明山仙颗粒对荷瘤小鼠NK细胞活性有明显的增强作用。NK细胞在机体防御及肿瘤监视中起重要作用。NK细胞对敏感的靶细胞的杀伤效应不受靶细胞是否表达MHC的影响。当予以生物反应调节剂全身或局部或在机体受病毒感染期间，实体组织中NK细胞明显增加，对监视体内微环境及干涉肿瘤的起到重要作用，故可以认为山仙颗粒抗肿瘤作用与激活NK细胞有

12、密切关系。许多因子如IFN-，IL-2等均可激活NK细胞，杀伤肿瘤靶细胞，活化的NK细胞可释放细胞因子TNF-，IL-2，IFN-等，呈正向调节作用，调节巨噬细胞的功能，扩大了抗肿瘤作用。3.2  实验表明山仙颗粒能够促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞对COnA的增殖反应，说明山仙颗粒能增强细胞免疫，而环磷酰胺抑制脾细胞对ConA反应，山仙颗粒能够拮抗免疫抑制药所致的免疫抑制。3.3  TNF-是由细菌脂多糖活化的单核巨噬细胞释放的细胞因子，与肿瘤细胞膜上的TNF-受体结合，特异性地杀伤肿瘤细胞，对机体的正常细胞无害，可致肿瘤细胞坏死。此外，TNF-还在体外与IFN-协同作用，诱导肿瘤

13、细胞凋亡。本实验表明山仙颗粒实验小鼠血清中TNF-的含量显著高于NS组及CY组，说明山仙颗粒能够促进荷瘤小鼠单核巨噬细胞分泌TNF-，从而提高荷瘤小鼠特异性免疫功能，达到抗肿瘤作用。3.4   IL-2是机体CD4+和CD8+细胞分泌的一种小分子物质，它在机体对肿瘤细胞的免疫监控中起着很重要的作用。首先，它可以诱导CTL，NK和LAK等多种杀伤性细胞的分化和效应功能，并能诱导杀伤细胞产生IFN-C，TNF-A等细胞因子；其次IL-2能促进细胞增殖、分化和抗体分泌。已经发现，活化的B细胞有IL2-R,IL-2对B细胞的调节作用，除通过刺激T细胞分泌B细胞增殖和分化因子外，还可能有直接调控作用，从而调节体液免疫；第三，IL-2可促进吞噬细胞通过ADCC机制杀伤肿瘤。此外，IL-2在体外可诱导肿瘤浸润淋巴细胞成为LAK-C。目前，LAK/IL-2对肾母细胞癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌有一定疗效3。本实验表明山仙颗粒组小鼠血清中IL-2的含量显著高于NS组及CY组，说明山仙颗粒能够提高荷瘤小鼠血清中IL-2的含量，从而提高荷瘤小鼠免疫功能，达到抗肿瘤作用。    综上所述，本实验说明山仙颗粒能够提高荷瘤