色谱分析导论(2)ppt课件

1、111 111 色谱法及其分类色谱法及其分类色谱法是一种分别技术，色谱法是一种分别技术， 是混合物最有效的分别、是混合物最有效的分别、 分析方法。分析方法。俄国植物学家茨维特在俄国植物学家茨维特在19061906年运用的安装年运用的安装色谱原型色谱原型安装，如右图所示。安装，如右图所示。茨维特实验茨维特实验一、色谱：一、色谱：色谱法又叫色层法、层析法，以试样组色谱法又叫色层法、层析法，以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差别分配、离子交换或其他亲和作用的差别为根据而建立起来的各种分别分析方法。为根据而建立起来的各种分别分析方

2、法。色谱柱：进展色谱分别用的细长管。色谱柱：进展色谱分别用的细长管。固定相：管内坚持固定、起分别作用的填充物。固定相：管内坚持固定、起分别作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或外表的冲洗剂。流动相：流经固定相的空隙或外表的冲洗剂。色谱法分别本质：当流动相中携带的混合物色谱法分别本质：当流动相中携带的混合物 流经固定相时，其与固定相发生相流经固定相时，其与固定相发生相 互作用。由于混合物中各组分在性互作用。由于混合物中各组分在性 质和构造上的差别，与固定相之间质和构造上的差别，与固定相之间 产生的作用力的大小、强弱不同，产生的作用力的大小、强弱不同， 随着流动相的挪动，混合物在两相随着流动相的

3、挪动，混合物在两相 间经过反复多次的分配平衡，使得间经过反复多次的分配平衡，使得 各组分被固定相保管的时间不同，各组分被固定相保管的时间不同， 从而按一定次序由固定相中流出。从而按一定次序由固定相中流出。二、色谱的分类：二、色谱的分类：1.1.按流动相和固定相的物理形状分类：按流动相和固定相的物理形状分类：色谱色谱气相色谱气相色谱流流气气液相色谱液相色谱流流液液气固色谱气固色谱气液色谱气液色谱液固色谱液固色谱液液色谱液液色谱2.2.按产生分别过程的相系统的方式分类：按产生分别过程的相系统的方式分类：柱色谱法柱色谱法毛细管色谱法毛细管色谱法平板色谱法平板色谱法 用玻璃柱子做色谱柱，用玻璃柱子做色

4、谱柱，固定相填装在柱子中固定相填装在柱子中用毛细管做色谱柱，固用毛细管做色谱柱，固定相填装在管壁定相填装在管壁用平整的板子作固定相用平整的板子作固定相支持的载体，固定相平支持的载体，固定相平铺在板上铺在板上3.3.按分别过程原理分类：按分别过程原理分类：吸附吸附萃取萃取静电作用和分散静电作用和分散分散分散生物特性生物特性 吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子交换色谱离子交换色谱凝胶色谱凝胶色谱生物亲和色谱生物亲和色谱4.4.按展开程序分类：按展开程序分类：洗脱法洗脱法 顶替法顶替法 迎头法迎头法 组分与固定相作用力组分与固定相作用力 流动相与固定相作用力流动相与固定相作用力 组分与固定相作用力

5、组分与固定相作用力 流动相或其他物质与固定相作用力流动相或其他物质与固定相作用力 三、色谱分别过程：三、色谱分别过程：色谱分别过程是在色谱柱内完成的色谱分别过程是在色谱柱内完成的112 112 色谱流出曲线和术语色谱流出曲线和术语一、线性洗脱色谱：一、线性洗脱色谱：1.1.分配等温线与分配系数分配等温线与分配系数K K：分配等温线：在一定温度分配等温线：在一定温度 下，溶质在固定相与流动下，溶质在固定相与流动 相之间的分配曲线，此曲相之间的分配曲线，此曲 线称为分配等温线。线称为分配等温线。 分配系数分配系数K K ：分配等温线：分配等温线 的斜率。的斜率。CmCsK 假设假设K K与浓度无关

6、，那与浓度无关，那么分么分 配等温线为直线；配等温线为直线； 在色谱过程中，图中在色谱过程中，图中 的的C C、D D型很少出现；型很少出现； A A、B B型常见，但不能型常见，但不能 用于测定；用于测定； 在溶质浓度低时，在溶质浓度低时，CsCs 根本上正比于根本上正比于CmCm，曲，曲 线近似直线。线近似直线。2.2.线性洗脱色谱：线性洗脱色谱：线性洗脱色谱。线性洗脱色谱。结论：结论：CSCS值大，那么值大，那么K K值大，溶质进入固定相的值大，溶质进入固定相的量就多。量就多。推论：推论： 溶质流过色谱柱时，分配系数溶质流过色谱柱时，分配系数K K值大的组值大的组分经过色谱柱所需时间长，

7、而分经过色谱柱所需时间长，而K K值小的组值小的组分经过色谱柱所需时间短。当样品中各分经过色谱柱所需时间短。当样品中各组分在两相的分配系数组分在两相的分配系数K K不同时，就能实不同时，就能实现差速迁移，到达分别的目的。现差速迁移，到达分别的目的。 二、相关术语：二、相关术语：色谱图：色谱图： 色谱柱流出物经过检测器时所产生的色谱柱流出物经过检测器时所产生的呼应信号对时间的曲线图。纵坐标为呼应信号对时间的曲线图。纵坐标为信号强度，横坐标为保管值。信号强度，横坐标为保管值。 只需流动相经过检测器时，只需流动相经过检测器时，在实验操作条件下，反映在实验操作条件下，反映检测器噪声随时间变化的检测器噪

8、声随时间变化的曲线。曲线。色谱峰样品峰顶色谱峰样品峰顶点到基线之间的垂直点到基线之间的垂直间隔，以间隔，以h h表示。表示。 保管值：保管值： 热力学要素热力学要素即组分在色谱柱中固即组分在色谱柱中固 定相上停留的时间。定相上停留的时间。不被固定相吸附或溶解的不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱柱时，从进组分进入色谱柱时，从进样开场到柱后出现该物质样开场到柱后出现该物质的峰极大点时所需的时间，的峰极大点时所需的时间，用用 tM tM表示。表示。 被分析组分从进样开场到柱被分析组分从进样开场到柱后出现被分析组分的峰极大后出现被分析组分的峰极大点时所需求的时间它包括点时所需求的时间它包括组分经过色谱

9、柱所需时间和组分经过色谱柱所需时间和组分与固定相作用所需的时组分与固定相作用所需的时间。间。 ，用，用tRtR表示。表示。某组分的保管时间扣除死时间某组分的保管时间扣除死时间后所剩的时间，用后所剩的时间，用 表表示。示。 =tR-tM =tR-tM 式中各项单位可用式中各项单位可用 min min、s s、cmcm等表示；等表示； 保管时间是色谱定性的根本根据，但同保管时间是色谱定性的根本根据，但同 一组分的保管时间受流动相流速的影响，一组分的保管时间受流动相流速的影响， 因此，色谱定性分析常采用保管体积等因此，色谱定性分析常采用保管体积等 定性。定性。 =tR-tM =tR-tM Rt 实践

10、上是组分在固定相中停留的总时间；实践上是组分在固定相中停留的总时间；Rt死体积死体积VMVM： 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒之间的空间、色谱仪器管路的空间粒之间的空间、色谱仪器管路的空间及检测器的空间的总和。或者说，在及检测器的空间的总和。或者说，在死时间内经过色谱柱的流动相体积。死时间内经过色谱柱的流动相体积。 VM=tM VM=tMF0F0流动相流速，流动相流速，L/minL/min保管体积保管体积VRVR： 在保管时间内经过色谱柱的流动相在保管时间内经过色谱柱的流动相体积。即将组分从柱中带出所需的体积。即将组分从柱中带出所需的流动相体积。流动相体积。

11、 VR=tR VR=tRF0F0相对保管值相对保管值 r21 r21： 某组分某组分2 2与组分与组分1 1的调整保管的调整保管值之比。值之比。 1 12 21 12 2R RR RR RR R2 21 1V VV Vt tt tr r某组分的保管体积扣除死体某组分的保管体积扣除死体积后的剩余体积，称为该组积后的剩余体积，称为该组分的调整保管体积。分的调整保管体积。 =VR-VM =VR-VM R RV V调整保管体积调整保管体积 ： R RV V r21 r21只与色谱柱温度和固定相的性质有关，与只与色谱柱温度和固定相的性质有关，与色色 谱柱的柱长、柱径、填充情况以及流动相流速谱柱的柱长、柱

12、径、填充情况以及流动相流速 无关，因此，它是一个广泛运用的定性数据；无关，因此，它是一个广泛运用的定性数据； r21 r21绝对不是两组分的绝对不是两组分的 VR VR或或tRtR之比；之比； 在多元混合物分析时，通常选择一对最难分别在多元混合物分析时，通常选择一对最难分别 的物质对，将它们的相对保管值作为重要参的物质对，将它们的相对保管值作为重要参 数。在这种情况下，数。在这种情况下，r21r21可用可用表示：表示： 1 12 2R RR Rt tt t 为后出峰的组分的调整保为后出峰的组分的调整保管时间，故管时间，故总是大于总是大于1 1的。的。 2 2R Rt t分配比分配比k k：也称

13、容量因子。它是指组分在固定也称容量因子。它是指组分在固定相和流动相中的分配量之比。相和流动相中的分配量之比。 MRMMRtttttk msVVKk121221KKkkrmsnnk量量组组分分在在流流动动相相中中物物质质的的组组分分在在固固定定中中物物质质的的量量区域宽度：动力学要素区域宽度：动力学要素 规范偏向规范偏向：0.6070.607倍峰高处倍峰高处色谱峰宽的一色谱峰宽的一半。半。 峰高一半处对峰高一半处对应的峰宽，用应的峰宽，用Y1/2Y1/2表示。表示。 色谱峰两侧拐点上色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的的切线在基线上的截距，用截距，用 Y Y表示。表示。 Y Y4 4 113 113

14、 色谱分析根本原理色谱分析根本原理一、色谱法中组分分别条件一、色谱法中组分分别条件A A、B B两组分沿色谱柱挪动时，不同位置处的浓度轮廓两组分沿色谱柱挪动时，不同位置处的浓度轮廓 两组分的分配系数必需有两组分的分配系数必需有 差别；差别； 区域扩宽的速率应该小于区域扩宽的速率应该小于 区域分别的速率；区域分别的速率；必要条件必要条件 在保证快速分别的前提下，提在保证快速分别的前提下，提 供足够长的色谱柱。供足够长的色谱柱。二、色谱法根本实际二、色谱法根本实际 塔板实际塔板实际 1.1.实际假设实际假设 将色谱柱视为精馏将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列塔，即色谱柱是一系列延续的、相等的程度

15、塔延续的、相等的程度塔板组成，每一块塔板的板组成，每一块塔板的高度用高度用H H表示，称为塔表示，称为塔板高度，简称板高。板高度，简称板高。 流动相进入色谱柱不是延续进展的，而是流动相进入色谱柱不是延续进展的，而是 脉动式，每次进气为一个塔板体积脉动式，每次进气为一个塔板体积(Vm)(Vm)； 一切组分开场时存在于第一切组分开场时存在于第0 0号塔板上，而且号塔板上，而且 试样沿轴纵向分散可忽略；试样沿轴纵向分散可忽略； 分配系数在一切塔板上是常数，与组分在某分配系数在一切塔板上是常数，与组分在某 一塔板上的量无关。一塔板上的量无关。塔板实际假设：塔板实际假设： 在柱内一小段长度在柱内一小段长

16、度H H内，组分可以在两相间内，组分可以在两相间 迅速到达平衡。这一小段柱长称为实际塔板迅速到达平衡。这一小段柱长称为实际塔板 高度高度H H；2.2.实际塔板数溶质平衡次数实际塔板数溶质平衡次数根据塔板实际假设，在每一块塔板上，溶质在根据塔板实际假设，在每一块塔板上，溶质在两相间很快到达分配平衡，然后随着流动相按两相间很快到达分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前挪动。对于一根长为一个一个塔板的方式向前挪动。对于一根长为L L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：的色谱柱，溶质平衡的次数应为：实际塔板数实际塔板数色谱柱的柱效随实际塔板数色谱柱的柱效随实际塔板数n n的添加而添加，的添加而添

17、加， 随板高随板高H H的增大而减小。的增大而减小。色谱柱分别混色谱柱分别混合组分的才干合组分的才干3 3塔板实际对色谱的解释：塔板实际对色谱的解释：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即实际塔板数第一，当溶质在柱中的平衡次数，即实际塔板数n n 大于大于5050时，可得到根本对称的峰形曲线；时，可得到根本对称的峰形曲线；第二，当样品进入色谱柱后，只需各组分在两相第二，当样品进入色谱柱后，只需各组分在两相 间的分配系数有微小差别，经过反复多次间的分配系数有微小差别，经过反复多次 的分配平衡后，仍可获得良好的分别；的分配平衡后，仍可获得良好的分别；第三，第三，n n与半峰宽及峰底宽的关系式为：与半峰宽

18、及峰底宽的关系式为：即在即在tRtR一定时，假设色一定时，假设色谱峰越窄，那么谱峰越窄，那么n n值越值越大，大，H H越小，柱效能越越小，柱效能越高。高。2R221RYt16Yt5.54n4.4.有效塔板数有效塔板数留意：同一色谱柱对不同物质的柱效能是不留意：同一色谱柱对不同物质的柱效能是不 同的。中选用这些目的表示柱效时，同的。中选用这些目的表示柱效时， 应指明对何种物质而言。应指明对何种物质而言。 有效有效2R221R有效nLHYt16Yt5.54n5.5.塔板实际的特点塔板实际的特点 定量阐明了溶质在色谱柱中挪动的速率；定量阐明了溶质在色谱柱中挪动的速率；胜利点：胜利点： 解释了流出曲

19、线的外形；解释了流出曲线的外形； 提出了计算和评价柱效能高低的参数。提出了计算和评价柱效能高低的参数。 缺乏点：缺乏点： 定性地给出板高的概念，却不能找出影定性地给出板高的概念，却不能找出影 响板高的要素；响板高的要素； 不能阐明为什么在不同的流速下，可以不能阐明为什么在不同的流速下，可以 测得不同的实际塔板数。测得不同的实际塔板数。 速率实际：速率实际： 速率实际指出：在色谱分别过程中，谱峰的扩速率实际指出：在色谱分别过程中，谱峰的扩 宽受涡流分散、分子分散和传宽受涡流分散、分子分散和传 质阻力三个动力学要素的控制。质阻力三个动力学要素的控制。板高方程为：板高方程为：A A、B B、C C

20、常数。常数。A A为涡流分散项系数为涡流分散项系数 B B为分子分散项系数为分子分散项系数 C C为传质阻力项系数为传质阻力项系数 流动相的平均线速度；流动相的平均线速度； MtLu 一定时，只需当一定时，只需当A A、B B、C C较小时，较小时，板高板高H H才干小，柱效才会高；反之，才干小，柱效才会高；反之，那么柱效低，色谱峰扩张。那么柱效低，色谱峰扩张。u1.1.涡流分散项涡流分散项A A变宽的程度由下式决议：变宽的程度由下式决议： A=2dpA=2dp A A与填充物的平均直径与填充物的平均直径dpdp和填充不规那么因子和填充不规那么因子有关，有关，与流动相的性质、线速度和与流动相的

21、性质、线速度和组分性质无关；组分性质无关； 运用颗粒细和均匀的填运用颗粒细和均匀的填料，采用均匀填充，是减小料，采用均匀填充，是减小涡流分散和提高柱效的有效涡流分散和提高柱效的有效途径。途径。气体分子的分子分散项系数气体分子的分子分散项系数B B为：为：B=2DgB=2Dg 弯曲因子。它表示柱填充物弯曲因子。它表示柱填充物 对分子分散的妨碍程度。对分子分散的妨碍程度。 Dg Dg 组分在气相中的分散系数组分在气相中的分散系数 cm2.s-1cm2.s-1。DgDg除与组分性除与组分性质质 有关外，还与组分有关外，还与组分 在气相中在气相中 的保管时间、柱温、柱压和载的保管时间、柱温、柱压和载

22、气的性质等要素有关。气的性质等要素有关。2.2.分子分散项分子分散项 为减小分子分散引起的色谱峰变宽，可采为减小分子分散引起的色谱峰变宽，可采用：用： 用较高的载气流速；用较高的载气流速； 运用相对分子量较大的载气；运用相对分子量较大的载气； 控制较低的柱温。控制较低的柱温。3.3.传质阻力项传质阻力项CC物质系统由于浓度不均匀而发生的物质物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移从一相转入另一相过程。迁移从一相转入另一相过程。影响传质过程进展速度的阻力。影响传质过程进展速度的阻力。传质：传质：传质阻力：传质阻力： 气相传质阻力系数气相传质阻力系数 Cg Cg CgCg描画影响组分从气相转移到固定

23、相描画影响组分从气相转移到固定相表表 面这一过程的传质速度的要素。面这一过程的传质速度的要素。呵斥谱峰扩宽呵斥谱峰扩宽 对于填充柱对于填充柱 ： 液相传质阻力系数液相传质阻力系数ClClClCl描画影响组分在液相中传质速度的描画影响组分在液相中传质速度的 要素要素 。a.a.降低固定液含量，降低固定液含量，dfdf减小，但容量因子减小，但容量因子k k也也 随之变小，对分别不利；随之变小，对分别不利； b.b.固定液含量一定时，固定液含量一定时，dfdf值随载体的比外表积值随载体的比外表积 添加而降低。因此，普通用比外表积较大的添加而降低。因此，普通用比外表积较大的 载体来降低载体来降低dfd

24、f值；值； c.c.提高柱温，提高柱温，DlDl增大，但增大，但k k值减小，故应控制值减小，故应控制 适当的柱温。适当的柱温。 4.4.范氏方程式速率实际方程式：范氏方程式速率实际方程式： 选择色谱分别条件具有重要的指点意义。它选择色谱分别条件具有重要的指点意义。它可以阐明固定相的填充均匀程度、粒度、液可以阐明固定相的填充均匀程度、粒度、液膜厚度、载气种类和流速等要素的变化对柱膜厚度、载气种类和流速等要素的变化对柱效和色谱峰展宽的影响。效和色谱峰展宽的影响。uDdk13k2Ddk1k01. 0uD2d2Hl2f2g2p22gp114 114 分别度分别度一、分别度一、分别度RsRs：定义：定

25、义： 相邻两组分色谱峰保管值之差与该两相邻两组分色谱峰保管值之差与该两组分色谱峰基线宽度平均值之比。组分色谱峰基线宽度平均值之比。定义式：定义式： 121R2R121R2RSYYtt2YY21ttR 121R2RSYYtt2R 当当RsRs1 1时，两色谱峰总是有部分重叠；时，两色谱峰总是有部分重叠； 当当Rs=1.0Rs=1.0时，两色谱峰的分别程度可达时，两色谱峰的分别程度可达 98% 98%； 当当Rs=1.5Rs=1.5时，两色谱峰的分别程度达时，两色谱峰的分别程度达 99.7% 99.7%。 当当RsRs值更大时，分别效果更好，但会延伸值更大时，分别效果更好，但会延伸 分析时间，使色

26、谱峰变宽，对分析反而不分析时间，使色谱峰变宽，对分析反而不 利。利。 Rs=1.5Rs=1.5为相邻为相邻两色谱峰完全两色谱峰完全分别的标志分别的标志二、影响二、影响RsRs的要素：的要素： 容量因子容量因子k k值增大，分别度增大，分析时间值增大，分别度增大，分析时间 延伸，甚至呵斥谱带检测困难。通常控制延伸，甚至呵斥谱带检测困难。通常控制 容量因子容量因子k=2k=27 7； 相对保管值相对保管值有微小增大，都会使有微小增大，都会使RsRs值有值有 较大添加。当较大添加。当=1=1时，时，Rs=0,Rs=0,不能分别。不能分别。 添加塔板数，可以添加分别度。添加塔板数，可以添加分别度。 R

27、s Rs降低板高的方法来增大塔板数降低板高的方法来增大塔板数22Sk1k14nR 例：用例：用3 3米长的填充柱进展色谱分别，得到如米长的填充柱进展色谱分别，得到如 以下图所示的分别。为了使二者刚好可以以下图所示的分别。为了使二者刚好可以分分 离完全，柱子长度最短需多少？离完全，柱子长度最短需多少？解：解：分析：分析：分别完全？分别完全？RsRs1.51.5最短柱长？最短柱长？分别分别条件条件不变，不变，H H、k2k2、为为常数常数后后前前后后前前后后前前LLLKLKRRSS22114kkHLRS解：解： 由题可知，分别条件未变，故板高由题可知，分别条件未变，故板高H H、相对、相对保管值保

28、管值、容量因子、容量因子k k等不变，它们是常数，等不变，它们是常数，那么有：那么有：对于对于3 3米长的色谱柱，由题给的条件可计算出米长的色谱柱，由题给的条件可计算出它的分别度它的分别度RsRs值。值。由图可知：由图可知：161117ttkMR22 1316114117ttRR12 222R2171611716Yt16n 31611613161131641716k1k14nR2223S 假设要完全分别，那么要求假设要完全分别，那么要求RsRs1.51.5，设此时，设此时需求柱长为需求柱长为LxLx，那么有：，那么有：X3X3SX3SLLLKLKRRXL31.53解之得：解之得：75. 0LX

29、答：略答：略115 115 色谱定性分析和定量分析色谱定性分析和定量分析一、定性分析：一、定性分析：色谱定性分析的义务：色谱定性分析的义务：比较知物质与未知物质在一样条件比较知物质与未知物质在一样条件下的保管参数或在固定相上的位置，下的保管参数或在固定相上的位置，即可确定物质物质是何种物质。即可确定物质物质是何种物质。确定色谱图上每一确定色谱图上每一个色谱峰所代表的个色谱峰所代表的是什么物质。是什么物质。方法：方法：二、定量分析二、定量分析 色谱定量分析的实际根据：色谱定量分析的实际根据：在一定色谱条件下，组分的质量或其在流动在一定色谱条件下，组分的质量或其在流动相中的浓度，与检测器的呼应值成正比。相中的浓度，