坐骨神经周围注射可乐定对CCI大鼠促炎性细胞因子表达的影响

1、坐骨神经周围注射可乐定对CCI大鼠促炎性细胞因子表达的影响        【摘要】  目的：观察损伤坐骨神经周围注射可乐定对慢性坐骨神经结扎模型(chronic constriction injury，CCI)大鼠促炎性细胞因子表达的影响，探讨2-肾上腺素受体激动剂是否对已经形成的神经病理性疼痛产生作用。方法：雄性SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只。Sham组：只分离皮肤、肌肉，不结扎坐骨神经;Sal组：形成CCI后注射生理盐水组;Clo组：形成CCI后注射可乐定组;Clo+Yo组：形成CCI后注射可

2、乐定和育亨宾组。在注射药物3 d后急性处死动物，取患侧脊髓L4、L5、L6背根神经节采取全自动化学发光法检测TNF-和IL-6浓度。结果：术后从7 d开始CCI大鼠脊髓背根神经节TNF-和IL-6浓度有明显增高。损伤坐骨神经周围注射可乐定能明显抑制CCI引起的脊髓背根神经节TNF-和IL-6的表达(P<0.01)。结论：损伤的坐骨神经周围注射可乐定可以降低促炎性细胞因子的表达。 【关键词】  可乐定;外周注射;CCI大鼠;神经病理性疼痛;TNF-;IL-6AbstractObjictive: To assess the effect of perineural clonidin

3、e on the expression of TNF- and IL-6 in the rats with chronic constriction injury(CCI) in the sciatic nerve. Methods：Thirty-two male SD rats were randomly divided into four groups(18 for each):sham group, Sal group (CCI+ saline), Clo group(CCI+clonidine) and Clo+Yo group(CCI+clonidine+ yohimbin). Th

4、e rats were killed 3 days after the injection of medicine mentioned above and spinal cord DRG of L4,L5,L6 were taken for determining the concentration of TNF- and IL-6 of DRG in the rats with automatic luminescent technique. Results: The rats of CCI group demonstrated steady mechanical and heat hype

5、raglsia from the seventh day after the operation. There was a remarkable increase in the concentration of TNF-a and IL-6 in DRG from the 7th day after the operation. Perineural injection of clonidine could suppress the expression of TNF- and IL-6 caused by CCI in the DRG of CCI rats(P<0.01). Conc

6、lusion: Perineural injection of clonidine modulates proinflammatory cytokines expression in CCI rats.Key wordsClonidine; Perineural inject; CCI; Neuropathic pain; TNF-; IL-6神经病理性疼痛(neuropathic pain)是指由于神经系统受到损伤或产生病变而导致的疼痛。病理生特点主要表现为痛觉的高反应性,如痛觉过敏( hyperalgesia)、痛觉超敏(allodynia)及自发疼痛( spontaneous pain)

7、等。神经病理性疼痛不同于由于组织损伤而导致的急性疼痛,通常呈慢性，可持续数天或数月,是目前临床的难点之一。可乐定( clonidine)是2-肾上腺素受体激动剂,临床上常用来治疗高血压。近年来发现它具有很好的缓解神经病理性疼痛的作用，多用于鞘内、静脉注射或伍用其他药物治疗慢性疼痛。本实验拟在经典的神经病理性疼痛模型CCI上，通过在结扎坐骨神经产生痛敏后，在损伤神经周围注射可乐定，探索外周注射可乐定是否对已经形成的疼痛产生影响,并通过检测促炎性细胞因子变化探索其可能参与的作用机制。1材料与方法1.1材料健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,体重(200±20) g，由广东医学实

8、验动物中心提供。动物置于(20±1) 和24 h昼夜循环的环境中，能够自由地获取水和食物。所有动物适应环境3 d后投入实验。盐酸可乐定注射液(035K0846)、盐酸育亨宾注射液(015K1444)以及TNF-、IL-6试剂盒均购自美国Sigma公司。1.2方法1.2.1动物分组随机将32只大鼠分为4组,每组8只。Sham组：只分离皮肤、肌肉，不结扎坐骨神经;Sal组：坐骨神经结扎后7 d注射生理盐水;Clo组：坐骨神经结扎后7 d注射可乐定组;Clo+Yo组：坐骨神经结扎后7 d注射可乐定和育亨宾组。1.2.2CCI模型的建立依照Bennet方法，大鼠腹腔注射10 %水合氯醛 (5

9、0 mg/kg)麻醉后，在一侧后肢剪毛消毒,在股骨外侧纵形切开皮肤,顺肌纹钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,游离周围组织,用3.0丝线结扎坐骨神经中段,使神经外膜轻度凹陷,但不阻断血供,缝合皮肤。假手术组只钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,游离周围组织，不结扎坐骨神经。术后7 d以MWT和TWL较基础痛阈下降40 %以上者视为CCI模型成功，投入实验。1.2.3注射药物操作CCI术后7 d，完成行为学测定后，水合氯醛麻醉动物。分别将1 mL生理盐水、1 mL盐酸可乐定注射液(150 g/kg)和1 mL盐酸可乐定注射液(150 g/kg)、盐酸育亨宾注射液(220 g/kg)和生理盐水混合液吸入1 mL注

10、射器。依照先前所示实验方法，在大鼠的大转子和坐骨结节间皮肤进针，然后向前内侧前进，沿坐骨神经走行扇形注射药液。在预试验中注射大鼠相同剂量的2 %利多卡因会使95 %受试大鼠产生短暂的单侧肢体麻木，证实药物注射在神经周围且发挥作用。1.2.4TNF-和IL-6的测定32只动物在注射药物3 d后，完成最后行为学测试，使用10 %水合氯醛麻醉动物，断头宰杀。收集4组每个动物患侧的L4、L5、L6的背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)。所有样本都被收集到1.5 mL的聚丙烯试管(无热源、经DN酶和RN酶处理)，称重后立即放入干冰，随后所有收集的组织都以-80 温度保存以待分析

11、。以每毫克组织10 L的比率加入正常细胞培养液和10 %灭活的牛血清，在冰浴中以超声匀浆器匀浆。然后以1 300×g速度离心，持续15 min，温度为4 。取上清液继续保持4 ，1 500×g速度离心10 min。取上清液采用全自动化学发光法，使用全自动化学发光免疫分析仪对上清液进行TNF-、IL-6含量测定。具体操作分别按TNF-试剂盒和IL-6试剂盒说明进行。重复测定2次，取其均值作为最后结果。1.2.7统计学处理采用SPSS11.0统计软件进行分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，两组均数间的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析

12、。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1动物模型行为表现实验期间，所有大鼠均保持良好状态，无明显伤口感染现象。Sham组大鼠活动如常。结扎坐骨神经大鼠左侧(结扎侧)出现舔爪、跛行，安静时患足常保持防御姿势。患侧足趾并拢并呈轻度外翻状。注射可乐定后，舔爪、跛行等行为减轻。2.2促炎性细胞因子变化2.2.1TNF-的变化与Sham组相比，注射药物3 d后， Sal组和Clo+Yo组大鼠背根神经节TNF-浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。Clo组大鼠背跟神经节TNF-浓度升高不明显，和Sal组、Clo+Yo组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。2.2

13、.2IL-6的变化与Sham组相比，注射药物3 d后，Sal组和Clo+Yo组大鼠背根神经节IL-6浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01);Clo组大鼠背跟神经节IL-6浓度升高不明显，和Sal组、Clo+Yo组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。表1促炎性细胞因子表达3讨论3.1神经病理性疼痛模型对神经病理性疼痛发病机制的研究大多来源于动物模型。Bennett和Xie等开发出的CCI模型与临床神经病理性疼痛特征有相似之处，制作过程相对简单而可靠，得到疼痛学界的广泛应用。该模型通过对坐骨神经松弛环扎，产生痛反应。可成功模拟神经病理性疼痛典型的自发痛、痛觉过敏和诱

14、发痛等症状并能维持一段时间。CCI模型损伤区域近端神经纤维正常，无显著DRG细胞死亡证据。1         3.2促炎性细胞因子和疼痛的关系TNF-是一类促炎性细胞因子，由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，是其它促炎性细胞因子级联反应的始动因素，可以诱发其它IL-1、IL-6、IL-8等促炎性细胞因子的产生。在组织中TNF-的水平和一些疼痛和痛觉过敏的程度有关1,2。皮下注射TNF-可以降低大鼠腓神经C-伤害感受器对机械刺激的激活阈值3。有研究发现，阻断TNF-可使各种神经病理性疼痛模型大鼠或小鼠的痛觉增敏4-5。神

15、经损伤后，雪旺氏细胞也产生TNF-，表明其与神经病理性疼痛有着密不可分的关系6-7。IL-6是另一种促炎性细胞因子，和神经病理性疼痛的形成和维持有极大关系8。激活的免疫细胞产生IL-6的过程和神经病理性疼痛有着密切联系。对于这点，早在1996年，DeLeo JA等9学者就对此做了相关的研究。他们制作成功坐骨神经冷冻大鼠模型(sciatic cryoneurolysis， SCN)后，使用免疫组化实验定位大鼠的脊索，显示在脊髓灰质和运动神经元IL-6的水平要高于正常对照大鼠。进一步实验又发现，在鞘内注射重组人IL-6正常大鼠，对正常触觉会产生异常性疼痛。这样，有理由认为，降低TNF-和IL-6等

16、促炎性细胞因子的产生可以改变慢性疼痛的发生和维持，对其产生的痛敏反应也会产生影响。3.3CCI术后促炎性细胞因子和2-肾上腺素受体变化坐骨神经结扎可以导致轴突损伤、局部炎症反应和华勒氏变性(Wallerian degeneration,WD)。神经束损伤后，首先活化神经内膜的成纤维细胞，产生部分趋化分子参与宿主防御反应。这些趋化分子使免疫细胞(主要是中性粒细胞和巨噬细胞)从循环中向神经聚集，产生促炎性细胞因子(TNF-、IL-1、IL-6)、NO、活性氧类(ROS)等参与免疫反应10。同时成纤维细胞产生的这些物质也直接使神经兴奋、损伤神经髓质以及改变血-神经屏障,从而使神经水肿，继而使更多的免

17、疫细胞、抗体等浸润，同时也改变临近神经纤维的结构和功能11。除了成纤维细胞，神经内膜一些驻留型的巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、上皮样细胞也被活化，也释放部分TNF-和IL-6等促炎性细胞因子，以及NO、ROS等免疫细胞趋化因子。还有包绕在外周神经周围的雪旺氏细胞活化，同样也会释放TNF-和IL-6等促炎性细胞因子。TNF-和IL-6等促炎性细胞因子可使外周神经脱髓鞘以及变性，增加传入神经的兴奋性，产生神经病理性疼痛12。同时，TNF-和IL-6等促炎性因子使损伤外周神经产生炎性反应可释放P物质，而P物质可使免疫细胞释放促炎性因子，从而形成P物质-促炎性细胞因子正反馈环。二者相互作用，加剧疼痛

18、的。还有学者发现，TNF-和IL-6等促炎性因子也可以逆向转运到背根神经节，引起背根神经节的交感神经出芽，从而产生神经病理性疼痛13。所以我们有理由认为TNF-和IL-6等促炎性因子是产生神经病理性疼痛的重要因素，同时也是痛信号向背角传递的重要介质之一。外周神经损伤可以导致损伤神经局部2-肾上腺素受体增多，从而导致痛觉过敏以及疼痛14。坐骨神经结扎48 h后，在神经损伤部位可有2-肾上腺素受体免疫反应性增强以及其和配体的结合增强15-16。对于神经损伤大鼠，注射去甲肾上腺素可以使30 %50 %的C纤维兴奋17。但这种作用可以被2-肾上腺素受体激动剂所阻滞。3.4外周注射可乐定对促炎性细胞因子

19、的影响大鼠施行CCI术后，BDG中TNF-和IL-6的表达明显增高。患侧坐骨神经周围注射可乐定可使CCI大鼠BDG中TNF-和IL-6的表达降低，育亨宾可以阻滞这种作用，这和外周注射可乐定减轻痛敏的作用相似。可以认为外周可乐定注射对CCI大鼠BDG中TNF-和IL-6表达的影响也与2-肾上腺素受体有关。先前的研究发现，外周注射可乐定可发挥2-肾上腺素受体作用使酵母多糖注射诱发神经炎性痛模型中T-淋巴细胞和单核/巨噬细胞调亡，从而减少了促炎性细胞因子表达。同时还认为2-肾上腺素受体激动剂刺激神经微环境改变促炎细胞性因子细胞表型，使促炎性细胞因子表达减少14。此研究结果也和本实验的结果相同。综上所

20、述，外周注射可乐定通过作用于2-肾上腺素受体发挥免疫调制作用，使诱发聚集在此的免疫细胞调亡，从而减少了促炎性细胞因子以及神经生长因子的产生。可乐定改变成纤维细胞、巨噬细胞、胶质细胞等免疫细胞释放TNF-、IL-6等促炎性因子表型，减少促炎性细胞因子的产生，从而使促炎性细胞因子向中枢的传送减少，减轻中枢致敏，从而产生止痛作用。对于临床上常见的外科手术、肢体离断等并发的顽固性慢性疼痛，可以尝试以外周注射可乐定作为的的选择。【】  1Tak PP, Smeets TJ, Daha MR, et al. Analysis of the synovial cell infiltrate in

21、early rheumatoid synovial tissue in relation to local disease activityJ. Arthritis Rheum,1997, 40(2):217-225.2Lindenlaub T, Sommer C. Cytokines in sural nerve biopsies from inflammatory and non-inflammatory neuropathiesJ. Acta Neuropathol, 2003,105(6):593 -602.3Junger H, Sorkin LS. Nociceptive and i

22、nflammatory effects of subcutaneous TNF-J. Pain, 2000,85(1-2):145-151.4Wagner R, Myers RR. Prosaptide prevents hyperalgesia and reduces peripheral TNFR1 expression following TNFalpha nerve injectionJ. Neuro Report, 1998,9(12):2827-2831.5Sommer C, Schmidt C, George A. Hyperalgesia in experimental neuropathy is dependent on the TNF receptor 1J. Exp Neurol, 1998,151(1):138-142.6Sommer C, Schafers M. Painful mononeuropathy in C57BL/Wld mice with