第7章蛋白质的分离纯化和表征

1、第 7章蛋白质的分离纯化和表征第七章蛋白质的分离、纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质每个解离基团的 pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点应通过等 电点聚焦和其他方法来确定。第二节蛋白质分子的大小和形状 首先，根据化学成分确定最低相对分子质量 假设只有一种微量组分，在测量其百分含量后，可以用比例公式计算 出最低相对分子质量。如果测量两种痕量组分的百分比含量， 并且通 过比例公式计算的最低相对分子质量不同， 则可以计算两种最低相对 分子质量的近似值的最小公倍数。实施例:纯酶含有1.65%亮氨酸(MR 131)和2.48%异亮氨酸(MR 131), 以找到最低的相对分子质量。解决方案:根据 Leu

2、 的百分比，最低 Mr x1: x1 = (100'131)/1.65 = 7939.4。最低X2先生:X2 = (100 ' 131)/2.48 = 528是3艮据lie的百分比含量计算的。由于 X1 和 X2 数之间的巨大差异，建议该酶包含一个以上的 Leu 和l i e 。为了估计 Leu 和 lie 的数量，首先计算 :X1/X2=7939.4/5282.31.5 .该酶含有的任何氨基酸的数量应为整数， 表明该酶至少含有 2个 Leu 和3个Ile ,其最小相对分子质量为7939.42=15878.8或5282.3 3=15846.9二、渗透压法测定相对分子质量三、沉降

3、分析法测定相对分子质量基本原则 :(a)离心力(Fc)当粒子 (生物大分子或细胞器 )在高速旋转下受到离心力时，离心力“ FC由以下公式定义:f = m a = m w 2ra-粒子旋转加速度，m-沉降粒子的有效质量，w粒子旋转角速度，r- 粒子旋转半径 (cm)。相对离心力 (RCF) 由于各种离心机转子的半径或离心管到转轴中心的距离不同， 离心力 也不同。因此，文献中常用 相对离心力”或 数Xg来表示离心力。只 要 RCF 值不变，样品在不同的离心机上可以获得相同的结果。RCF 是转换成重力加速度的实际离心力场的倍数。x 是离心转子的径向距离，单位为厘米。 g 是地球的重力加速度 (980

4、 厘米/秒2); n是转子每分钟的转数，缩写为r/min或rpm。(3) 沉降系数根据 Svedberg 1924 年对沉降系数的定义，单位离心力场中颗粒运动 的速度。X1:离心前颗粒与旋转轴的距离；X2:离心颗粒离旋转轴的距离。通常 是 10-13秒，所以沉降系数 1 0- 1 3秒被称为斯维德伯格单位，缩写为 S,维数为秒。例如，动物原生质体核糖体的沉降系数等于80S,即80X10-13S。细胞及其组分的沉降系数差异很大，因此可以根据生物样品中沉降系数 的差异，通过离心作用将它们彼此分离。(4) 沉降速度对于球形粒子 :fc = 1/6 n D3( p p) 3 2X ff = 3 n d

5、v当 Fc二Ff 时，1/6 n D3 ( pp? p m)w 2X= 3w dv.v=(1/18 n )d2( ?pp pm)32X(5) 沉降系数与物质的相对分子质量根据斯维德伯格公式，沉降系数可以计算物质的相对分子质量:Mr二RTSXXXX , O Farrel等人根据不同生物分子之间等电点和相 对分子质量的不同特点，建立了第一方向为IEF-聚丙烯酰胺凝胶电泳，第二方向为十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳的双向分离技 术，简称IEF/十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；基本原理与IEF-佩奇和SDS-佩奇完全相同。通常，第一方向的IEF- 佩奇使用超薄水平板，并且在电泳完成后，切割所需

6、的泳道以用于第 二方向的电泳，或者在 1毫米的内径处在毛细管中进行第一次IEF-聚丙烯酰胺凝胶电泳，取出橡胶条进行第 二次电泳。第一种电泳方法与IEF-聚丙烯酰胺凝胶电泳相同，只是在 制备胶时应加入 2%的两性电解质和 6mol/L 尿素。在第二方向电泳中， SDS-PAG被倾倒在垂直玻璃板之间，在上部具有大约2厘米的空间。聚合后，第一方向胶带被转移到第二方向胶带。 用载玻片轻轻将胶带 压直，加入3卩L 1%溴酚蓝指示剂，用1%琼脂糖(用电极缓冲液制备) 密封胶带。琼脂糖凝固后， 可以进行电泳。当溴酚蓝接近凝胶板的下 边缘时，电泳停止。在第二次电泳中，使用梯度混合器将凝胶制成 7.5%-15%

7、的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。技术。具有特异性和可逆亲和力的生物分子成对匹配。主要有 : 酶和底物、 酶和竞争抑制剂、 酶和辅酶、抗原和抗体、脱氧核糖核酸和核糖核酸、 激素及其受体、脱氧核糖核酸和结合蛋白等。在成对的生物分子中， 它们中的任何一个都可以用作固定相， 而样品溶液中的另一个分子可 以进行亲和层析以达到分离和纯化的目的。 例如，酶和辅酶成对配对。 辅酶可用作固定相来分离和纯化样品中的酶， 或酶可用作固定相来分 离和纯化样品中的辅酶。六、高效液相色谱和快速蛋白质液相色谱 高效液相色谱，又称高压液相色谱、高速液相色谱和现代液相色谱， 是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技

8、术。 它特别 适用于高沸点、 不气化或热稳定性差的有机物的分离和分析， 在生物 化学和分子生物学中的应用越来越广泛。高效液相色谱在高压下使液体通过色谱柱，在室温下分离混合组分， 通过检测器将其转化为电信号， 并通过记录仪跟踪或数据处理装置显 示测量结果。它具有高压、高速、高效率和高灵敏度的特点。(a)咼压由于高效液相色谱使用液体作为流动相， 并且液体在通过色谱柱时比气体更有抵抗力，因此有必要施加高压，通常为 15-30兆帕，最高 50 兆帕。(2) 高速 由于高效液相色谱采用高压， 流动相液体流速加快， 一般分析周期为 几分钟至 10 分钟，比经典的液相柱色谱快得多， 但比气相色谱稍慢。(3) 高效率由于高效液相色谱的高柱效 (每米塔板数可达 5000)，有时一个柱可以 分离几十个甚至几百个组分。(4) 高灵敏度利用灵敏的探测器和自动装置，可以探测到10-9g甚至10-11g的物质。 所需的样本量非常少， 通常只需要几十微升的样本就可以进行全面分 析。由于上述特点， 高效液相色谱自 20 世纪 70 年代以来发展迅速。 人们 普遍认为， 当有机物质的相对分子质量较低且沸点较低时， 气相色谱 可以用来分析有机物质。当沸点较高(> 450°C)、不能蒸发或热稳定性 差时，可以使用高效液相色谱分析。如果条件不允许，不能购买昂贵 的仪器，可以