湖北汉族人群对乙肝疫苗免疫应答的水平与HLA-I类分子多态性

1、湖北汉族人群对乙肝疫苗免疫应答的水平与HLA-I类分子多态性的相关研究涂正坤吴雄文刘敏姜晓丹杨志章吴锋龚非力赵修竹中国图书分类号R392.11R394.5R311.144R730.3摘要目的：探讨人群对乙肝疫苗免疫应答与HLA遗传多态性的相关性。方法：对52名湖北汉族健康自愿者进行HBV血源疫苗标准全程接种，共3次(第0、1、6月)，末次接种后8 w用酶免疫法(EIA)检测血清抗HBs抗体水平：S/N2.1为应答者；S/N2.1为无应答者。同时对受试者进行HLA-I类抗原多态性检测。结果：应答者42人(81.0%)，无应答者10人(19.0%)；无应答者与HLA-B39具有显著相关性，RR17

2、.5，25.22，P0.05，而与HLA-B62呈负相关，26.41，P0.05。结论：在湖北汉族人群中，HLA-B39表型阳性个体对乙肝疫苗免疫应答水平明显低于其他个体，而HLA-B62表型阳性个体明显高于其他个体。关键词人类白细胞抗原乙肝疫苗免疫应答Association between the feature of the immune response to hepatitis B vaccine and HLA class I polymorphism in a Hubei population of the Han nationalityTU Zheng-Kun ，WU Xiong

3、-Wen， LIU Min et al. Department of Immunology,Tongji Medical University,Wuhan 430030AbstractObjective:To study association between the feature of the immune response to hepatitis B vaccine and HLA genetic polymorphism on human.Methods:52 healthy volunteers of the Han nationality from Hubei province

4、were subjected to a standard course of immunization with HBV plasma vaccine at month 0,1 and 6 successively. 8 weeks after the last immunization,serum level of anti-HBs antibody were assayed with EIA.Individuals with S/N2.1 are responders,and S/N2.1 are nonresponders. Results:42(81.0%) of the 52 sub

5、jects were responders,10(19.0%) individuals were nonresponders.Unresponsiveness of the 10 individuals to hepatitis B vaccine were found to be positively associated with HLA-B39(RR17.5,2=5.22,P0.05) and negatively associated with HLA-B62(2=6.41,P0.05),as demonstrated by HLA-I antigen polymorphism ana

6、lysis.Conclusion:The level of immune response to hepatitis B vaccine of individuals bearing HLA-B39 antigen was significantly lower than others,individuals bearing HLA-B62 antigen was significantly higher than others.Key wordsHLAHepatitis B vaccineImmune response乙肝疫苗是取自慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者血液、通过灭活并纯化的乙肝表

7、面抗原(HBsAg)，它的问世为乙型肝炎的预防提供了有力的武器，使乙型肝炎及其续发症(慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌等)得到了有效的控制。但并非所有接种乙肝疫苗者均能免遭HBV感染，人群对乙肝疫苗的免疫应答存在明显的个体差异，据此可将接种人群分为应答者和无应答者。影响个体对乙肝疫苗应答能力的因素包括年龄、性别、疫苗的品牌、是否吸烟、HLA型别等，其中HLA在人类对乙肝疫苗的免疫应答中起重要作用。研究无应答人群的免疫遗传学背景，将有助于进一步完善无应答人群的HBV预防对策，也有助于进一步阐明人类免疫应答基因(Ir gene)的生物学意义。本课题选择湖北汉族人群进行乙肝疫苗标准全程接种，观察其应答水

8、平，并分析该组人群HLA-I类表型频率，以探讨无应答人群与HLA-I类抗原多态性的关联情况。1材料与方法1.1主要材料HLA-I类分型血清板(澳大利亚皇家佩思医院临床免疫科Dawkins教授惠赠)可检出HLA-A抗原特异性11种，HLA-B抗原特异性25种；血源型加热灭活乙肝疫苗(卫生部武汉生物制品研究所)；抗-HBs(EIA)酶免疫法试剂盒(上海实业科华生物技术有限公司)；RPMI 1640(Gibco公司)。1.2实验对象及接种程序选择湖北省鄂州市汀祖镇王边村52名健康自愿者进行乙肝疫苗标准全程接种(第0、1、6月肌肉注射)，受试者年龄在1040岁之间，其中男性28名、女性24名。在全程接

9、种后8 w采集外周静脉血标本。1.3方法1.3.1外周血单个核细胞的分离取2.5 ml全血与等量RPMI 1640培养液混匀，小心加在5 ml淋巴细胞分离液上，1 600 r/min离心30 min，收集单个核细胞层，用RPMI 1640培养液洗2次，离心去上清，重新用20%FCS RPMI 1640培养液悬浮，调整细胞浓度为1106个/mm3。1.3.2HLA-I类抗原分型采用国际通用的微量淋巴细胞毒试验。简言之，在含有已知HLA-I类抗血清的反应板中加入外周血淋巴细胞，然后加入兔补体，充分作用后加入染料，在倒置相差显微镜下判断结果。阳性细胞着色且体积增大，表示待检淋巴细胞表面具有已知抗血清

10、所针对的抗原；存活细胞不着色，透明而较小。1.3.3抗HBs抗体测定取受试者血清，借助酶免疫法(EIA)检测抗HBs抗体水平。简言之，加入待测标本于包被HBsAg的反应板中，设抗HBs抗体阴性对照和阳性对照各2孔，空白对照1孔，然后加酶结合物，充分混匀，孵育37 1 h，洗涤后加底物液，置37孵育15 min，然后加终止液。用酶联检测仪测定OD492nm值，按下列公式计算并判断结果S/N：。由于多种因素可能影响EIA检测结果，为避免实验操作而致的误差，对每份样本连续检测3次，取平均OD值判断结果。S/N2.1为应答者，S/N2.1为无应答者。1.4统计处理相对危险性(Relative risk

11、,RR)按Woolf公式：RR=ad/bc。a为携带特定HLA型别的无应答者人数；d为不携带特定HLA型别的应答者人数；b为不携带特定HLA型别的无应答者人数；c为携带特定HLA型别的应答者人数。四格表卡方检验按公式： 。如1T5、N40，则采用校正公式：2结果52名受试者HLA-I类分型结果和抗HBs抗体水平见表1。52例中无应答者为10名(19.0%)，应答者为42名(81.0%)。HLA-I类抗原型别与乙肝疫苗无应答的相关性见表2。10名无应答者中携带HLA-B39表型者为3人，其比例明显高于应答者(42人)中携带HLA-B39表型者(1人，2=5.22，P0.05，RR=17.5)。4

12、2名应答者中携带HLA-B62表型者为14人，而10名无应答者中无一人携带HLA-B62(2=6.41，P0.05)。此外，HLA-A2、A24、B16、B17、B40、B46等表型与乙肝疫苗免疫应答无明显关联。其他HLA型别由于在本实验中检出的频率较低，无统计学意义。 表1湖北汉族人群52名个体HLA-I类分子多态性和抗HBs抗体水平Tab.1HLA class I phenotype and level of anti-HBs antibody in 52 individuals tested in this studySpecimen ID HLA-I phenotype Level o

13、f anti-HbsAb Specimen ID HLA-I phenotype Level of anti-HbsAb A B OD S/N A B OD S/N D409 A1 A2 B5 B62 0.49 5.76 D4371) A2 A10 B39 0.16 1.88 D4101) A2 B12 B39 0.13 1.52 D438 A2 2.69 31.64 D411 A2 3.00 35.29 D439 A10 B35 3.32 39.05 D412 A25 B53 1.60 18.82 D4411) A10 B40B17 0.13 1.52 D4131) A2A24 B16B46

14、 0.14 1.64 D442 A2A10 B40 1.37 16.11 D414 A2A10 B40B62 2.21 26.00 D443 A2A10 B46 0.19 2.23 D417 A2 B46B17 0.18 2.11 D444 A2A11 B62 0.28 3.29 D4181) A2 B16B13 0.09 1.05 D446 A11A2 B12B5 2.47 29.05 00D419 A10A24 B62 2.73 32.11 D447 A2A11 B5B46 1.78 20.94 D420 A2 2.36 27.76 D548 A2 B5 2.84 33.41 D421 B

15、5 3.32 39.05 D549 A2 B62 1.07 12.58 D4221) A33 B17 0.15 1.76 D550 A2 B16B27 0.78 9.17 D423 A10 0.44 5.17 D551 A2 B16B13 3.19 37.52 D424 A25 B7B14 1.21 14.23 D5521) A9 B39B27 0.15 1.76 D425 A2 B46 0.19 2.23 D553 A2 B13B46 2.43 28.58 D426 A2A25 B62 0.33 3.88 D554 A2 B46 0.54 6.35 D427 A33A25 B46B17 1.

16、22 14.35 D555 A2 B62 2.79 32.87 D428 A1A2 B46B62 0.42 4.94 D556 A2 B46 0.29 3.41 D429 A1A2 B7B62 0.78 9.17 D5571) A11 B5B40 0.15 1.76 D430 A10 B40 1.46 17.17 D558 A24 B40B46 3.04 35.76 D431 A28 B35 3.32 39.05 D5591) A2 B5 0.15 1.76 D4321) A24A25 B46 0.11 1.29 D560 A9 B40 0.20 2.35 D433 A2 B46 3.32 3

17、9.05 D561 A9A10 B62B40 0.32 3.76 D434 A2 B5B15 3.20 37.64 D561 A9A10 B62B40 0.32 3.76 D435 B35B12 2.19 25.76 D563 A2A33 B62 1.08 12.70 D436 A2 B62 2.58 30.35 D564 A2A33 B62 2.53 29.76 Note:1)Nonresponder,ie anti-HBs S/N2.1.The reaction to the used HLA anti-sera is negative表2乙肝疫苗应答者与无应答者HLA-I类表型频率的比较

18、Tab.2Comparison of HLA class I phenotype frequencies in responders and nonresponders to hepatitis B vaccineHLA-phenotype Nonresponders Responders P B39 3 1 0.05 B62 0 14 0.05 B16 2 2 N.s B46 2 11 N.s B17 2 2 N.s B40 2 6 N.s A2 5 25 N.s A24 2 2 N.s Note:N.s:not significant3讨论HLA复合体是位于人类第6号染色体短臂上的一组紧密

19、连锁的基因群，其编码产物在抗原提呈和免疫调节中发挥重要作用；并且，HLA基因还控制人类对各种抗原的应答能力和对疾病的易感性。已证实，小鼠对HBsAg的免疫应答与H-2相关；H-2f和H-2s单体型表现为无应答；H-2b和H-2k为中度应答；而H-2d和H-2a为高应答1，2。HBsAg是最早发现的一种在人和小鼠的免疫应答中与MHC相关的抗原，虽然人和小鼠MHC的结构与功能有许多共同特点，然而与人类免疫应答相关的特异性MHC基因的定位，迄今尚无直接证据。其原因在于，人群为随机婚配群体，且HLA基因系统具有高度多态性。尽管如此，已有许多研究者报道，人类对乙肝疫苗的免疫应答与HLA相关。由于所研究的

20、人群不同，各家所获得的结果不尽相同。本课题对52名健康个体进行血源型乙肝疫苗标准全程接种，结果发现应答者为42人(81.0%)，无应答者为10人(19.0%)，无应答率介于白种人群(7.0%15.0%)和日本人群(22.4%)之间3，4。此外，通过HLA多态性分析证实，无应答者与HLA-B39表型显著相关(RR17.5，P0.05)；无应答与HLA-B62表型呈负相关(P0.05)。本课题未观察到其他HLA-I类表型与乙肝疫苗免疫应答关联。在本实验中，人群对乙肝疫苗的免疫应答与年龄、性别无关。在日本人群中，乙肝疫苗无应答者与HLA-Bw54、DR4、DRw53表型具有极强相关性，RR值分别为5

21、.47、2.57和15.934，但未发现HLA与HBsAg高应答存在关联5。在白种人群中，携带HLA-DR3、-DR7表型或携带扩展单体型HLA-B8-SC91-DR3、HLA-B44-Fe31-DR7的个体无应答率极高6，7；而HLA-DR1与HBsAg高应答相关8。上述结果与本课题所获结果不同，其原因可能是由于不同人群遗传背景存在差异，从而与HBsAg无应答关联的HLA表型亦不同。涂正坤现在广州市妇婴医院医学遗传研究所，广州510180作者简介：涂正坤，男，33岁，免疫遗传学专业硕士生；指导教师，龚非力，男，教授，博士生导师，主要从事分子免疫和免疫遗传学研究作者单位：(同济医科大学免疫学教

22、研室，武汉430030)4参考文献1Milich D R,Leroux-Roels G G,Chisari I V.Genetic regulation of the immune response to the hepatitis B surface antigen (HBsAg) ，qualiative characteristic of the humoral immune response to the a，d and y determinates of HBsAg .J Immunol,1983;130:13952Milich D R， Leroux-Roels G G,louie

23、R E et al Genetic regulation of the immune response to the hepatitis B surface antigen(HBsAg)IV，distinct H-2-linked Ir gene control antibody response to different HBsAg determinates on the same molecule and map to the I-A and I-C subregions.J Exp Med,1984;159:413Nowicki M J， Tong M J， Bohman R E. Alterations in the immune response in nonresponders to the hepatitis B vaccine. J Infect Dis,1985;152:12454Watanabe H， Matsushita