过钒酸钠对照射后BET

1、过钒酸钠对照射后BET            过钒酸钠对照射后BET    2008-5-9 12:28:18                           

2、60;                     【关键词】  BET-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(m)；细胞凋亡；过钒酸钠    摘要： 目的   研究酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠（Pervanadate，Per）对电离辐射作用后细胞线粒体膜电位(m)改变和细胞凋亡的影响。方法   应用流式细胞仪测定电离

3、辐射作用后鼠源性髓系白血病细胞株BET-2细胞线粒体膜电位及其在过钒酸钠干预后的改变和细胞凋亡水平。结果   电离辐射早期可引起BET-2细胞线粒体膜电位降低，诱导细胞凋亡发生；过钒酸钠在一定程度上稳定细胞线粒体膜电位，减少细胞凋亡。结论   过钒酸钠可逆转电离辐射诱导的细胞线粒体膜电位的降低，减少造血细胞凋亡的发生。    关键词： BET-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(m)；细胞凋亡；过钒酸钠    Effects of pervanadate on MMP of B

4、ET-2 cells induced by ionizing irradiation       Abstract： Objective   To study the effects of pervanadate(Per),the inhibitor of protein tyrosine phosphotases on the alterations of mitochondrial membrane potential(MMP)and the apoptosis of BET-2 cells induced b

5、y ionizing irradiation.Methods   BET-2 cells were divided into Per-treated groups and non-Per groups and incubated after ionizing irradiation.The MMP and apoptosis were measured with FCM.Results   After irradiation was given,the MMP of BET-2 cells was reduced in the early stage s

6、ignificantly,and the apoptosis appeared,and these changes had a dose-dependent pattern and a time-course fashion.Per potently enhanced the MMP of BET-2 cells and prevented irradiation-treated cells from apoptosis.Conclusion   Per reversed the repression of mitochondrial membrane potential

7、and suppress apoptosis induced by ionizing irradiation in the hematopoietic cells.    Key words： BET-2 cell;ionizing irradiation;mitochondrial membrane potential(MMP,m);apoptosis;pervanadate(Per)      细胞凋亡是电离辐射导致造血系统损伤的主要方式。预防与控制造血干/祖细胞大量凋亡，有效恢复机体造血功能，在未来

8、可能爆发的核事故、核战争以及肿瘤放射治疗副反应控制等领域都具有十分重要的意义1。造血细胞信号转导过程受蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotases，PTP）的调控2。过钒酸钠（pervanadate，Per）作为PTP特异性抑制剂，参与细胞内多条信号通路信息的传递过程的调节3。通过改变PTP活性调控造血细胞受体信号转导通路，可能成为继重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、重组血小板生长因子（TPO）等细胞因子之外的促进辐射造血损伤修复的发展方向4。本研究观察Per对照射后BET-2细胞线粒体膜电位改变及细胞凋亡的影响，探讨调控造血细

9、胞受体信号通路中PTP活性对造血细胞电离辐射损伤的保护作用。结果报告如下。    1   材料与方法    11   材料       111   BET-2细胞   BET-2细胞为促红细胞生成素（EPO）依赖的鼠源性髓系白血病细胞株(军事医学科学院第3研究所张明伟惠赠)。悬浮于含10马血清的1640完全培养基中，加入EPO至终浓度为2U/ml，置37，5CO2孵箱培养，隔日

10、换液，取指数生长期细胞用于试验。    112   主要试剂与仪器   罗丹明123、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司)。原钒酸钠（NaVO3）、双氧水（H2O2）：用双蒸水配制为200mmol/L的储存液，过滤除菌，4保存。促红细胞生成素（EPO）活性为1×105U/mg，纯度>95，由北京放射医学研究所汤仲明教授提供。MODEL 450型酶联仪（美国BIO-RAD公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickson公司）。   &

11、#160;12   方法       121   照射条件   军事医学科学院放射医学研究所60Co射线照射源，一次照射剂量分别为3，5Gy，剂量率为148157Gy/min。    122   Per制备5   将200mmol/L原钒酸钠50l及200mmol/L H2O250l加入400l 1640培养液中，21水浴反应15min，加入5lH2O2酶终止反应。用1640培养液稀释成应用液现配

12、现用。    123   MTT方法   将待测细胞用RPMI 1640培养液洗涤3次，台盼兰染色计数活细胞，用上述完全培养基分为无Per组及Per实验组（Per终浓度为5mol），调整细胞浓度至3×105/ml，每孔100l加入96孔板中；Per用RPMI 1640递减稀释后，每孔加入100l，每组做3个复孔，37培养48h，加MTT(50mg/ml)20l，继续培养4h，离心，弃上清，加入200l二甲基亚砜（DMSO），振荡助溶，在MODEL450酶联仪上测492，630nm双波长的A值，以Per浓度

13、指数为横坐标，以A值纵坐标绘图。应用ORIGIN version294软件中Logistic程序进行拟合处理分析。    124   细胞线粒体膜电位(m)测定6   取1×105细胞，PBS洗涤2次，加入罗丹明123储存液至终浓度为10mol/L，室温下平衡30min，PBS洗涤3次，PBS稀释至细胞浓度为1×105/ml，上机检测，激发光波长为488nm，计数1×104个细胞，测定细胞相对荧光强度，数据经流式细胞仪Kolmogorov-Smirnov Statistics软件进行结

14、果分析。    125   细胞凋亡检测   按德国宝灵曼公司Annexin-V-FLUOS凋亡分析试剂盒说明书进行。取约1×106细胞，PBS洗涤，200g×5min，弃尽上清，重悬于100lAnnexin-V-FLUOS标记缓冲液1000l溶液中预先加入20lAnnexin-V-FLUOS单抗及20l50g/ml溴化丙锭(PI)中，避光，室温放置1015min，加溶液(100mmolHepes/NaOH,pH74,140mmolNaCl,5mmolCaCl2)04ml，上机检测。2 

15、;  结果    21   BET-2对EPO细胞增殖反应性（图1）   培养基中EPO浓度<05U/ml时，BET-2细胞增殖停止；在12U/ml之间即有良好促增殖作用；EPO浓度>4U/ml，其促增殖能力已达饱和。表明BET-2细胞对EPO有较好的依赖性，保持了稳定的生物学特性。    图1   BET-2对EPO的增殖反应性（略）    22   Per对BET-2细胞

16、增殖反应性（图2）   当Per浓度<005mol/L时，对细胞无明显效果；Per625mol/L时，导致细胞死亡；而在13125mol/L时可明显促进BET-2细胞在缺乏EPO状况下的增殖。提示适量Per具有细胞因子样作用，可促进BET-2细胞增殖。因此，在下述实验中，使用Per的终浓度为5mol/L。    图2   BET-2对Per的增殖反应性（略）    23   Per对电离辐射所致BET-2细胞增殖抑制的影响（图3） 

17、0; 对于未照射的BET-2细胞，适当浓度Per可明显促进BET-2细胞在缺乏EPO状况下的增殖；对于5Gy射线照射后的BET-2细胞，13125mol/L的Per仍能明显促进BET-2细胞在缺乏EPO状况下的增殖。提示电离辐射可能导致细胞信号转导过程中负调控酪氨酸磷酸酶作用的增强，抑制细胞的增殖。    24   Per对电离辐射后BET-2细胞MMP改变的影响   未处理的BET-2细胞相对荧光强度为18111±899，3Gy照射细胞相对荧光强度为16420±870，5Gy照射细胞相对荧光强

18、度为13093±910，组间比较差异均有统计学意义(P<001)，表明随着照射剂量增加，细胞线粒体膜电位(m)呈逐渐下降的趋势。5Gy照射12h后细胞相对荧光强度为10263±856，而照射即刻加入Per（终浓度为5mol/L），细胞相对荧光强度为16837±915(未处理的BET-2细胞相对荧光强度为18359±1422)，组间比较差异有统计学意义(P<001)，表明Per可明显缓解照射后BET-2细胞线粒体膜电位(m)下降的程度。    25   Per对电离辐射后BET-2细胞凋亡的影响   5Gy照射后12h,存活细胞（LL象限）比例为6729