DNA重组实验步骤Word版

1、DNA重组实验步骤 要求：1每个同学需要的3张照片参见黄色字体。2 写实验报告的时候请将相应的试剂盒的实验步骤写入，本文仅作参考，不能照抄。试剂盒的说明书在实验室桌子上都有。第一组：目的基因：GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶： 片段大小：496bp第二组：目的基因：Actin 肌动蛋白，片段大小 ：约200bp1.总RNA的抽提（参照植物组织RNA提取试剂盒，本部分直接以提供材料开始，可以不写）所取材料经DEPC水（蚕体或组织）清洗后，添加液氮充分研磨；然后转入1.5 mL Eppendorf管，加入1 mL TRIzol，振荡2 min，室温静置5 min；4，12 000 r/min离心5

2、 min，上清转入新的Eppendorf管中；以每毫升TRIzol 0.2 mL氯仿的比例加入氯仿，振荡15 s 左右，室温放置5 min，12 000 g，4离心15 min；取上清液，加0.6 mL异戊醇，颠倒混匀，静置10 min；4，12 000 g离心10 min，弃上清；加入1 mL 用DEPC水配置的75%乙醇洗RNA沉淀，室温晾干；将沉淀溶于50 µL DEPC水中，-70保存备用。2RNA反转录 (参照RT-PCR试剂盒)在Eppendorf管中加入组织总RNA 1 L，Oligo (dT)18 1 L，40 U/L RNase Inhibitor 0.5 L，5&

3、#215;reaction buffer 4 L, 2.5 mmol/L dNTP 2L, 200 U/L RTase M-MLV 1 L, 然后加DEPC水至20 L；42水浴1 h，然后70灭活10 min，此即为第一链cDNA产物。3 .PCR扩增反应程序及加样体系 (参照RT-PCR试剂盒)PCR扩增反应程序（上海生工试剂）：94预变性3 min，94 50 s，55（根据引物适当改变） 50 s, 72 50 s, 30个循环。终延伸72 10 min。反应体系总体积25 L，反应体系中加入：ddH2O16.3 L10× PCR Buffer （without Mg2+）2

4、.5 L25 mmol/L MgCl22.0 L2.5 mmol/L dNTP mix1.0 LPrimer-s1.0 L （约20 pmol/L）Primer-a1.0 L （约20 pmol/L）cDNA1.0 L （约2.0 ng）1 / 3Taq DNA 聚合酶0.2 L （约1.0 U）总体积25.0 L1.2% Agarose凝胶电泳，记录拍照结果。4 .PCR产物的回收与连接 DNA回收参照天根Agarose Gel DNA Purification Kit 使用说明书。连接：在微型离心管中依次加入纯化PCR产物8 µL（目的基因），pUC19 2µL，buf

5、fer 4ul，dNPT 1ul，T4连接酶1ul，水4ul，共20ul体系。11度20分钟后70度5分钟即可。5 感受态细胞制备挑取大肠杆菌DH5A划线培养得到的单菌落；挑单菌落接种于3 mL LB液体培养基过夜培养，然后取30 µL菌液接种于3 mL LB液体培养基，37 200 r/min震荡培养至OD550达0.5左右（液体变浑浊即可）；将培养液转入1.5 mL离心管，冰浴10 min；4，3500 r/min离心5 min，弃上清；用预冷的75 mmol/L CaCl2 750 µL轻轻悬浮细胞，冰浴30 min；4，3500 r/min离心10 min，弃上清；

6、加入200 µL预冷的75 mmol/L CaCl2轻轻悬浮细胞，冰浴4 h以上，即成感受态细胞。6 .连接产物的转化取200 µl感受态细胞悬液，加入连接产物10 µL，轻轻混匀，冰浴30 min；42水浴1 min，立即置于冰浴中2-3 min，然后向离心管中加入1 mL 37预热LB培养基，于37 200 r/min振荡培养1 h，使细胞恢复正常生长状态；4，3500 r/min离心5min，弃900 µL 上清，加入5 µL X-gal(20 mg/mL)和5 µL IPTG（100 mg/mL），轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布

7、在含Amp+抗生素的LB固体培养基上；正面放置1 h使吸收完全，然后37倒置培养过夜。7 重组质粒的筛选观察蓝白斑结果（拍照记录，培养皿上有自己的名字，没有的本次实验重做），挑取单个独立的白色菌落（可将培养基平板放置4°C冰箱显色），分别接种于3 mL含有相应抗生素的 LB液体培养基上，37 °C 200 r/min震荡培养过夜。 8质粒DNA抽提（参照试剂盒）质粒DNA小量制备试剂盒。9 酶切反应在1.5mL的Eppendorf管中依次加入ddH2O 10 µL，10×Buffer 2 µL，质粒6 µL，两种不同限制性内切酶各1 µL，组成20 µL酶切体