上海交通大学微生物实验课件实验九动物病毒培养

1、实验九实验九病毒的分离与培养病毒的分离与培养p101实验目的理解常规的病毒培养的基本方法理解常规的病毒培养的基本方法掌握利用鸡胚培养病毒的原理掌握利用鸡胚培养病毒的原理掌握鸡胚接种的基本路径掌握鸡胚接种的基本路径学会鸡胚的鉴别学会鸡胚的鉴别病毒的种类专性活细胞寄生专性活细胞寄生动物病毒动物病毒l鸡胚接种鸡胚接种l细胞培养细胞培养植物病毒植物病毒细菌病毒细菌病毒l噬菌体噬菌体从病料中分离病毒从病料中分离病毒一、样本的采集与处理一、样本的采集与处理1 1、一般原则：、一般原则： 合适的时间，合适的病变部位，合适合适的时间，合适的病变部位，合适的处理和保存方法的处理和保存方法 一般都要一般都要44保

2、存保存2 2、病料的种类、病料的种类动物样本：动物样本：（1 1）心、肝、肺、脾、肾脏和淋巴结等实质性器官）心、肝、肺、脾、肾脏和淋巴结等实质性器官（2 2）各种液体病料）各种液体病料 （3 3）肠内容物和肠壁）肠内容物和肠壁（4 4）皮肤病料）皮肤病料 （5 5）骨）骨 （6 6）脑、脊髓）脑、脊髓 植物样本：植物样本： 发病植株的根、茎、叶、花、果等发病植株的根、茎、叶、花、果等环境样本环境样本水样、土壤、动物粪便等水样、土壤、动物粪便等；采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采集有关脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。集有关脏器、内

3、容物、分泌物、排泄物或其他材料。在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学调查、抗体检测、群体健康评估或环境卫生检测时，调查、抗体检测、群体健康评估或环境卫生检测时，样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。B. B. 无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品应作好标。应作好标。C. C. 采集新鲜病料：动物发病后应立即采集病料，否则，采集新鲜病料：动物发病后应

4、立即采集病料，否则，尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学检查的病料更应及时采集。检查的病料更应及时采集。注意事项注意事项3、送检病料样本的标记送检病料样本的标记（1 1）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、死）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、死亡时间等。亡时间等。（2 2）流行病学、临床表现、病理剖检等初步诊断材）流行病学、临床表现、病理剖检等初步诊断材料。料。（3 3）免疫接种和用药治疗情况。）免疫接种和用药治疗情况。（4 4）病料中是否加有一些特殊的保护剂。）病料中是否加有一些特殊的保护剂。（5 5）送检的目的和要求。）送检的

5、目的和要求。（6 6）姓名和联系方式。）姓名和联系方式。4、待检病毒材料的处理：、待检病毒材料的处理：（1 1）组织材料需经剪碎、研磨后，以汉克氏液作）组织材料需经剪碎、研磨后，以汉克氏液作1 1：1010稀释，每毫升加入青、链霉素各稀释，每毫升加入青、链霉素各1000IU1000IU，再反复冻融，再反复冻融3 3次，使病毒从细胞中释放出来，次，使病毒从细胞中释放出来，3000-40003000-4000转转/ /分钟分钟离心离心2020分钟，取上清液微孔滤膜过滤后作为接种物。分钟，取上清液微孔滤膜过滤后作为接种物。（2 2）分泌物、粪便等材料则可直接以汉克氏液作）分泌物、粪便等材料则可直接以

6、汉克氏液作1 1：1010稀释，每毫升加入青、链霉素各稀释，每毫升加入青、链霉素各1000IU1000IU，44放置过放置过夜，夜，3000-40003000-4000转转/ /分钟离心分钟离心2020分钟，取上清液作为接分钟，取上清液作为接种物。种物。（3 3）接种物在接种前需做细菌培养试验，只有无菌接）接种物在接种前需做细菌培养试验，只有无菌接种物才可进一步使用。种物才可进一步使用。（4 4）植物样本经剪碎、研磨、离心、过滤后接种植株）植物样本经剪碎、研磨、离心、过滤后接种植株哪些方法可以分离培养病毒？各有什么优点？鸡胚接种基本原理鸡胚培养的优点：鸡胚培养的优点：l鸡胚作为病毒的敏感细胞，

7、能支持病毒完成从吸鸡胚作为病毒的敏感细胞，能支持病毒完成从吸附到基因组复制、转录、蛋白质合成、装配、释附到基因组复制、转录、蛋白质合成、装配、释放的整个生命过程，从而使得病毒得以增殖。放的整个生命过程，从而使得病毒得以增殖。接种路径：羊膜腔，尿囊腔，绒毛尿囊膜，接种路径：羊膜腔，尿囊腔，绒毛尿囊膜，胚体和卵黄囊接种等胚体和卵黄囊接种等不同的病毒必须采用不同的接种路径不同的病毒必须采用不同的接种路径鸡胚培养病毒的用途：分离、增殖、毒力测鸡胚培养病毒的用途：分离、增殖、毒力测定、疫苗制备等。定、疫苗制备等。动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养接种前的准备鸡胚的孵化鸡胚的孵化鸡胚的活力鉴别鸡胚的活力鉴别

8、样本的前处理样本的前处理确定采用的接种路径确定采用的接种路径本次实验严格的无菌操作本次实验严格的无菌操作实验步骤1 1、照蛋：、照蛋：活胚：有鲜红的血管、摇动有黑点、黑点运动活胚：有鲜红的血管、摇动有黑点、黑点运动灵活。灵活。死胚：血管比较暗、摇动时黑点运动不灵活死胚：血管比较暗、摇动时黑点运动不灵活无精蛋：均匀透明、无血管和黑点无精蛋：均匀透明、无血管和黑点2 2、划出气室、划出气室 找出血管相对较少的部位找出血管相对较少的部位3 3、消毒气室、消毒气室 先用碘酊棉球，在用酒精棉球脱碘先用碘酊棉球，在用酒精棉球脱碘4 4、打孔器打孔、打孔器打孔 在气室的斜上方中心在气室的斜上方中心5 5、病

9、毒接种、病毒接种 灭菌注射器取灭菌注射器取0.20.2毫升病毒液（毫升病毒液（鸡新城鸡新城疫病毒的稀释液？疫病毒的稀释液？），沿孔垂直插入约），沿孔垂直插入约1.51.5厘米进行接种（厘米进行接种（尿囊腔接种尿囊腔接种）6 6、石蜡封闭接种孔、石蜡封闭接种孔（石蜡加热时温度不要（石蜡加热时温度不要太高，以防燃烧）太高，以防燃烧）7 7、鸡胚培养、鸡胚培养 标记后，于标记后，于3737培养培养48-7248-72小时。小时。2424小时内死亡鸡胚必须剔除小时内死亡鸡胚必须剔除（为什么？如何判定非病毒引起的死亡？）（为什么？如何判定非病毒引起的死亡？）病毒是否有增殖？8 8、下次实验要验证病毒，观察鸡胚