大血藤、牡丹皮、赤芍有效组分间对肠道致病菌体外抑菌的协同作用

1、大血藤、牡丹皮、赤芍有效组分间对肠道致病菌体外抑菌的协同作用4l0丹参素的改善微循环,抗炎,抗氧化作用保护了胰腺组织功能通道不被大量破坏可能是其机制.那格列奈,丹参素这种对通道表达的调节是治疗糖尿病的一个重要机制.本研究从基因学和分子生物学角度探索糖尿病的发病机制,有助于寻找更为平安有效的降糖药物并说明其降糖机制,中西医结合治疗糖尿病将具有较好的疗效和应用前景.参考文献:1KohtaroM,TakashiM,TakashiK,eta1.RolesofATPSensitiveKChannelsasMetabolicSensorsStudiesofKir6.XNullMiceJ.Dia.betes

2、,2004,53(Supp1.3):176.2KosterJC,PermuttMA,NicholsCO.DiabetesandInnSecretionTheATPSensitiveK+Channel(KATe)ConnectionJ.Diabetes,2005,54(11):3065.3ProksP,GirardCAshcroftFM.FunctionaleffectsofKCNJIImutationscausingneonataldiabetes:enhancedactivationbyMgATPJ.HumanMolecuJalGenetic&,2005,14(18):271

3、7.4ShimomuraK,GirardCAJ,ProksP,eta1.Mutationsatthesameresidue(RSO)ofKir6.2(KCNJI1)thateanseneonataldiabetesproducedifferentfunctionaleffectsJ.Diabetes,2OO6,55(6):1705.5HussainK,CosgloveKE.Fromeongetritallhyperinsulinismtodiabetes中国中西医结合外科杂志20O8年8月第l4卷第4翅mellituss:theroleofpancreaticficellKATPchannel

4、sJj.PediatricDiabetes,2005,6(2):103.6YokoiN,KanamoriM,HorikawaY,eta1.Associationstudiesofvari-antsinthegenesinvolvedinpancreaticbetacellfunctionintype2dia-betesinJapanesesubjectsJ.Diabetes,2OO6,55(8):2379.7OlofssonCS,CollinsS,BengtssonM,eta1.Longtermexposuretoglucoseandlipidsinhibitsglucoseinducedin

5、sulinsecretiondownstreamofgranulefusionwithplasmanlenlbraneJ.Diabetes,2007,56(7):1888.8AndreaM,AmaliaG,JamesEF,eta1.口一CellFunctioninMildType2DiabeticPatientsEffectsof6一monthglueloweringwithnateglinideJ.DiabetesCare,2005,28(5):1132.9TiinamaijaT,E1inaHH,B0I,eta1.ImprovedPrandialGlucoseCon-tmlWithLower

6、RiskofHypoglycemiaWithNateglimdeThanWithGlibenelamideinPatientsWithMaturityOnsetDiabetesoftheYoungType3JJ.DiabetesCare,2006,29(2):189.10钟佩茹,林秀珍.丹参注射液对正常大鼠血小板胞浆内游离钙浓度的影响J.中国中西医结合外科杂志,2005,11(2):141.11张铁良.丹参对急性胰腺炎大鼠氧自由基水平的影响J.中国中西医结合外科杂志,2004,10(1):34.(收稿:20071102修回:20210410)(责任编辑刘洪斌田在善)大血藤,牡丹皮,赤芍有效组分

7、间对肠道致病菌体外抑菌的协同作用王宇歆一,李惠芬,周静,杜凡摘要目的:观察大血藤,牡丹皮及赤芍有效组分合用对四种腹腔感染细菌的协同抑制作用.方法:提取大血藤中绿原酸,牡丹皮中丹皮总苷和赤芍中的赤芍总苷三种抑菌组分,定量后以大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌,粪肠球菌为实验菌株,琼脂二倍稀释法和棋盘试验法评价三种抑菌组分单用与联用的体外抑菌效果.结果:三种组分单用均对四种细菌的标准株及临床株有抑菌效果,其中绿原酸对大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌和粪肠球菌的MIC分别为8.5vg/mL,34vg/mL,8.5vg/mL,2.125vg/mL,丹皮总苷对四菌株的MIC分别为86t,g/m

8、L,344t,g/mL,21.5t,g/mL,86t,g/mL,赤芍总苷对四菌株的MIC分别为117.5t,g/mL,470t,g/mL,117.5t,g/mL,11-7.5t,g/mL;绿原酸与丹皮总苷合用对铜绿假单胞菌和粪肠球菌有局部协同作用,丹皮总苷和赤芍总苷合用对粪肠球菌有局部协同,绿原酸与赤芍总苷合用对四种细菌均为无关作用.结论:所提取的三种组分均具有抑菌活性,合用后抑菌活性增强.关键词:大血藤;牡丹皮;赤芍;抑菌作用中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:10076948(2021)04041004天津市科技开展方案工程(05YFGDSF02600)1.天津医科大学药学院(

9、天津300070)2.天津市中西医结合急腹症研究所中国中西医结合外科杂志2OO8年8月第l4卷第4期411SynergisticAntibacterialEffectofEffectiveComponentsofS.Cuneata,P.SufnuticosaandP.LactifloraforPathogenicEnteralBacteriaWangYuxin,LiHuifen,ZhouJing,eta1.TianjinMedicalUniversity,Tianjin(300070),ChinaAbstract:ObjectiveToinvestigatesynergisticantibac

10、terialeffectoftheeffectivecomponentsofS.cuneata,P.sufnuticosaandP.1actifloraforfourabdominalinfectionbacteria.MethodsSeparationandanalysisofthecMom-genicacidinS.cuneata,totalpaeoniflorininP.snfnuticosaandP.1actifloraweredone.UsingE.coli,K.pneumonia,P.aemginosaandE.faecalisastesterstrains,2一foldagard

11、ilutionandcheckerboardtitrationmethodwereappliedtovaluatetheantibacterialeffectofthesingleeffectivecomponentorcombiningeffectivecomponents.ResultsThreesingleeffectivecomponentscouldinhibitfourtypesofstareesingleeffectivecomponentshaveantibacterialactivityforfourbacteria.Thecombiningeffec-tivecompone

12、ntshavestrongerantibacterialactivitythanasingleeffectivecomponent.Keywords:sargentodoxacuneata,paconiasnfnuticosa,paeonialactiflora,antibacterialactivity根据中药配伍的相须相使原那么,我院将大血藤,牡丹皮,赤芍及元胡组方为凉血活血方,临床使用已30余年,用于腹腔感染性疾病的瘀滞期治疗,如单纯性阑尾炎或腹腔脓肿的消散期,疗效确切.本实验对该方药有效组分抑制肠道致病菌的机制进行了初步研究并对大血藤,牡丹皮和赤芍有效组分单用及联用后的抑菌活性进行了观

13、察.1材料与方法1.1材料1.1.1仪器及设备美国Agilent1100高效液相色谱仪,DAD检测器,Agilent色谱工作站,SSI高效液相色谱仪,分析之星色谱工作站,甲醇色谱纯,乙腈色谱纯,磷酸分析纯,双蒸水自制.绿原酸,芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供.1.1.2药材来源大血藤为木通科大血藤Sargento.doxacuneata(Oliv.)Rehd.etWils.的枯燥藤茎,牡丹皮为毛茛科植物牡丹(PaconiaSnfnuticosaAndr.)的枯燥根皮,赤芍为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPal1.)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch.

14、)的枯燥根.大血藤(批号060721),牡丹皮(批号05070147),赤芍(批号060721)均购自河北安国,经天津中医药大学药学院张丽娟教授鉴定.1.1.3供试菌种大肠埃希菌标准株ATCC25922,肺炎克雷伯菌标准株ATCC700603,铜绿假单胞菌标准株C27853,粪肠球菌标准株ATCC29212由中国药品生物制品检定所提供.从急腹症临床别离培养的大肠埃希菌,肺炎克雷伯杆菌,铜绿假单胞菌,粪肠球菌由天津市南开医院微生物室提供.1.1.4培养液营养琼脂MuellerHinton(MH)琼脂干粉及水解酪蛋白肉汤粉购自英国Oxoid公司.1.2方法1.2.1供试品的提取制备取大血藤药材置烘

15、箱中50枯燥,粉碎过50目筛.精密称取大血藤药材枯燥粉末5g,加10倍量70%乙醇,75热回流提取2次,每次2h,合并提取液滤过,适当浓缩过复合型大孔树脂柱,先用2倍柱体积水洗脱除杂,再使用6倍柱体积的30%乙醇洗脱,洗脱流速为12mL/min,收集洗脱液,浓缩蒸干,即为大血藤有效组分;牡丹皮,赤芍药材置烘箱中50%枯燥,粉碎过50目筛.分别精密称取各5g,加10倍量70%乙醇,热回流提取2h,1h,1h,共3次,温度控制微沸,滤过合并滤液,适当浓缩过复合大孔树脂柱,先用3倍柱体积水洗脱除杂,再用56倍柱体积的50%乙醇洗脱,洗脱流速为3mL/min,收集洗脱液,浓缩蒸干,即为二者有效组分.1

16、.2.2供试品中目标物含量的测定大血藤供试品中绿原酸含量测定:色谱条件KromasilCl8色谱柱(250mm×4.5mm,5/an),流动相为0.4%磷酸水溶液:乙腈(85:15),流速为1.0mL/mL,检测波长为327Bin,柱温室温.配制0.03mg/mL对照品溶液.绘制标准曲线,计算回归方程为:Y=2E+07X一48192,R=0.9993,采用外标法计算绿原酸的质量分数,得大血藤中绿原酸的含量.牡丹皮,赤芍供试品中芍药苷含量测定:色谱条件KromasilC,8色谱柱412(150i/ira×4.6i/ira,5/Jan),流动相为甲醇:0.2%磷酸水溶液(30:

17、70),流速1.0mL/min,检测波长为230mn,柱温室温.配制0.2mg/na对照品溶液.绘制标准曲线,计算回归方程为Y=0.406X+79.574,R=0.9990,采用外标法计算芍药苷的质量分数,得牡丹皮,赤芍中芍药苷的含量.1.2.3体外抑菌实验抑菌药液的配制将大血藤有效组分配置成18mg/na的药液(绿原酸含量0.17mg/na);牡丹皮有效组分配置成64mg/na的药液(芍药苷含量1.72mg/na);赤芍有效组分配置成48mg/na的药液(芍药苷含量2.35mg/mL),经0.22/Jan滤膜过滤除菌后备用.接种菌的制备:分别从保存菌种的培养基斜面上将各菌株移至酪蛋白水解肉汤

18、中,35培养6h,以此对数生长期菌液制备浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液,即1.5×lOS/mL.有效组分单用体外抑菌实验:以琼脂二倍稀释法测定大血藤,牡丹皮,赤芍中抑菌活性成分对大肠埃希菌,肺炎克雷伯杆菌,铜绿假单胞菌,粪肠球菌的标准株及临床株四种腹腔感染细菌的最低抑菌浓度(MIC),另设蒸馏水为阴性对照1.有效组分两两合用体外抑菌实验:根据单味药抑菌实验结果,按棋盘试验法计算局部抑菌浓度(兀C)指数.1.3结果判读有效组分单用体外抑菌实验结果判读:含最低药物浓度的培养基中,无细菌生长者,那么为最低抑菌浓度(MIC).有效组分两两合用体外中国中西医结合外科杂志2021年8月第1

19、4卷第4期抑菌实验结果判读:FIC指数判读公式=药金旦丛.旦药金丛当A药单用时的MIC十B药单用时的MIC.FIC<0.5,为协同作用;0.5<FIC1,为局部协同或相加作用;1<FIC2,为无关作用;FIC>2,为拮抗作用l2.各组实验重复3次,结果完全一致.2结果2.1大血藤中绿原酸的含量为0.17%,牡丹皮中芍药苷的含量为1.72%,赤芍中芍药苷的含量为2.35%,即100g中药中,三者目标物含量分别为0.17g,1.72g和2.35g.详见表1.表1三味药材提取有效组分含量的实验结果2.2单用体外抑菌实验大血藤,牡丹皮和赤芍中抑菌

20、活性成分对大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌和粪肠球菌标准株,临床株均有抑制作用,但抑菌效果不同.大血藤中绿原酸对所试四种菌株抑菌作用最强,丹皮总苷对铜绿假单胞菌的标准株,临床株抑制作用最强,赤芍总苷对四种菌株的抑制作用较均衡.详见表2,表3.表2大血藤,牡丹皮和赤芍中有效组分单用体外最低抑菌浓度结果MIC)绿原酸(tc,/mL)丹皮总苷(mL)赤芍总苷(g/mL)8.586117.58.586117.554M4470343444708.52.1252.12521.58686117.5117.5117.52.3两两合用体外抑菌实验大血藤中绿原酸与丹皮总苷合用对铜绿假单胞菌和粪肠球菌表现为部

21、分协同作用;丹皮总苷与赤芍总苷合用对粪肠球菌也具有局部协同作用;大血藤中绿原酸与赤芍总苷合用对四种细菌表现为无关作用.详见表4.3讨论“有效组分是近年来化学领域研究中医药派生出来的一个新的概念E3,主要是指在中药复方或单味药材中具有相似化学性质的一大类化合物,中医药领域亦曾称之为近似名称有效部位,甚至还混淆称为有效成分.总之,无论何种称谓都是为解中国中西医结合外科杂志2O08年8月第l4卷第4期决中医药深层次研究中的具体问题,在复方与化学成分中间引入的一个新的层次.确实我们在考察抑菌活性成分的抑菌作用中也遇到这个难题,其中混有大量杂质或其它共存物质,根本无法说清抑菌作用,为揭示中药确切发挥抑菌

22、作用的化学物质,弄清抑菌作用机制,我们嫁接了以上概念用于本实验研究.本实验结合我院多年临床用药经验及先期对各药效成分含量的测定,确定大血藤,牡丹皮和赤芍的抑菌活性成分分别是绿原酸,丹皮总苷和赤芍总苷【_5J,并行含量测定,进而选择了近年来腹腔感染致病菌谱的前四种菌株(大肠埃希菌36.45%,肺炎413克雷伯菌13.55%,肠球菌8.37%,铜绿假单胞菌7.77%)j考察抑菌活性.发现该方药中的不同组分抑菌对象不同,作用强弱不同,联用后抑菌作用对象宽,作用各有偏重,这就真正表达了中药的整体综合治疗作用.另外,本实验不仅选用了标准细菌株还选用了其对应的临床株,而临床株是我们直接由腹腔感染病人别离出

23、来的菌株,且大局部为耐药株,但实验数据证实标准株与临床株单用MIC值完全相同,联用FIC值显着降低,提示该方药不易产生耐药,与临床用药情况一致.表4大血藤,牡丹皮和赤芍中有效组分两两合用体外抑茵作用的FIC值大血藤是凉血活血方中主要药味,具有清热解毒,活血祛风之成效,含有多种化学成分,包括木脂素,鞣质,绿原酸,皂苷,生物碱,黄酮等,绿原酸及其衍生物是大血藤中重要的药效组分.国内外研究说明,绿原酸可直接作用于细菌细胞壁抑制细菌细胞壁的合成,使其具广泛抑菌活性.赤芍总苷及丹皮总苷是赤芍及牡丹皮的主要有效成分,本实验研究说明其抗菌作用强,抗菌谱广,但具体作用机制及与绿原酸在抑菌中的协同作用机理还有待进一步实验的深入研究.参考文献:1马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册M.北京:科学出版社.2001:210.【2GeorgeM,Eliopoulos,RobertC,ela1.AntimicrobialCombinations.AntibioticsinLaratoryMedicineM,4tled,NewYork:Williams&