血红蛋白的提取和分离(1)ppt课件

1、 简述蛋白质提取和分别的根本原理，并了解简述蛋白质提取和分别的根本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分别生物大分子的根凝胶色谱法、电泳法等分别生物大分子的根本原理。本原理。1 1、主要概念：凝胶色谱法、主要概念：凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲缓冲溶液溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。么作用。2.2.主要原理：凝胶色谱法分别蛋白质的原理主要原理：凝胶色谱法分别蛋白质的原理 电泳法分别样品的原理电泳法分别样品的原理 缓冲溶液的组成缓冲溶液的组成和作用机理和作用机理3 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4 4、课题难点：

2、样品的预处置、课题难点：样品的预处置 色谱柱填料色谱柱填料的处置和色谱柱的装填。的处置和色谱柱的装填。 大多数凝胶是由多糖类化合物如葡聚糖或大多数凝胶是由多糖类化合物如葡聚糖或琼脂糖构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。琼脂糖构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分别的蛋白质相对分子质量的大小，利根据被分别的蛋白质相对分子质量的大小，利器具有网状构造的凝胶的分子筛作用，来进展分别。器具有网状构造的凝胶的分子筛作用，来进展分别。 当相对分子量不同的蛋白质经过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质经过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子量较小的蛋白质容易进

3、入凝胶内部的通道，路程较长，挪动速度较慢挪动速度较慢; ;而相对分子量较大的蛋白质无法进入而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部挪动，路程较短，挪凝胶内部的通道，只能在凝胶外部挪动，路程较短，挪动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分别。根据的特性是：蛋白质分子量的大小。分别。根据的特性是：蛋白质分子量的大小。 在一定的范围内，凡是可以抵抗外加少量强在一定的范围内，凡是可以抵抗外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液酸或强碱的影响使原来溶液PHPH值根本坚持不变的混值根本坚持不变的混合溶液。合溶液。 可以抵抗外界的酸和

4、碱对溶液可以抵抗外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH根本不变。根本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂溶解于水种缓冲剂溶解于水中配制而成。调理缓冲剂的运用比例就可以制得在不中配制而成。调理缓冲剂的运用比例就可以制得在不同同PHPH范围内运用的缓冲液。范围内运用的缓冲液。 利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常构造和功能，便于察看血红蛋白的正常构造和功能，便于察看( (红色红色) )和科和科 学研讨学研讨( (活性活性) )磷酸缓冲液磷酸缓冲液带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

5、 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极挪动。电泳利分子会向着与其所带电荷相反的电极挪动。电泳利用了待分别样品中各种分子带电性质的差别以及分子用了待分别样品中各种分子带电性质的差别以及分子本身的大小，外形的不同，使带电分子产生不同的迁本身的大小，外形的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分别。移速度，从而实现样品中各种分子的分别。琼脂糖

6、凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 在电场的作用下，这些带电分子会向在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极挪动着与其所带电荷相反的电极挪动 1 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠钠SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状构造的凝胶。三维网状构造的凝胶。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移

7、率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等要素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等要素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中参为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中参与与SDSSDS。 SDS SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会解聚成单条肽链，的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDSSDS能与各能与各种蛋白质构成蛋白质种蛋白质构成蛋白质SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所带负电

8、荷所带负电荷的量大大超越了蛋白质分子原有电荷量。因此掩盖的量大大超越了蛋白质分子原有电荷量。因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。取决于分子的大小。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。样品处置样品处置粗分别粗分别纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定一蛋白质提取和分别步骤一蛋白质提取和分别步骤二操作过程二操作过程

9、 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分别血红蛋白。动物的血液来分别血红蛋白。 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分别纯化，洗涤次数不可过少。分别纯化，洗涤次数不可过少。 1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心、低速短时间离心速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分别的效果一同沉淀，达不到分别的效果3 3、汲取血浆：上层、汲取血浆：上层透明的黄色血浆。透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为分数为0.90

10、.9的氯化钠溶液洗涤。的氯化钠溶液洗涤。5 5、低速离心低、低速离心低速短时间速短时间6 6、反复、反复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已步骤三次，直至上清液中已没有黄色，阐明洗涤干净。没有黄色，阐明洗涤干净。初次离心后的结果3次洗涤后的结果 加蒸馏水到原血液体积，再加加蒸馏水到原血液体积，再加4040体积的甲苯体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌，置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分钟加速细胞破裂分钟加速细胞破裂, ,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。静置片刻后，分出下层的红色透静置片刻后，分出下层的红色透明液体。明液体。 过程：取过程：取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析

11、袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液中磷酸缓冲液中pHpH为为7.07.0，透析，透析1212小时。透析目小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。的：除去样品中分子量较小的杂质。利用透析袋透析 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两端需厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制造：打孔用砂纸磨平。底塞的制造：打孔挖出凹穴挖出凹穴安装安装移液管头部移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，目尼龙纱包好，插到玻璃管的一

12、端。本卷须知：底塞中插入的玻璃管插到玻璃管的一端。本卷须知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么难以铺实的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分别不彻底。尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分别不彻底。顶塞的制造：打孔顶塞的制造：打孔安装玻璃管。组装：将上述三安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属构造。者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属构造。装配好的凝胶柱明色谱柱制造胜利明色谱柱制造胜利留意：正确的加样操作：留意：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝、不要触及并破坏凝胶面。胶面。2 2、贴壁加样。、贴

13、壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕挪动。、使吸管管口沿管壁环绕挪动。搜集得到的纯化后的蛋白让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持构造和功能。范围内，维持构造和功能。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分别时可以血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分别时可以经过察看颜色来判别什么时候应该搜集洗脱液。这使血经过察看颜色来判别什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白的分别过程非常直观，大大简化了实验操作。红蛋白的分别过程非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分别的程序可分为四大步，包括：样品处血红蛋白提取和分别的程序可分为四大步，包括：样品处置、粗分别、纯化和纯度鉴定。首先

14、经过洗涤红细胞、血红蛋置、粗分别、纯化和纯度鉴定。首先经过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即白的释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即: :样品的处置；样品的处置；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分别；然后经再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分别；然后经过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即: :样品样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。2 2、他装填的凝胶色谱柱能否有气泡产生？他的色谱、他装填的凝胶

15、色谱柱能否有气泡产生？他的色谱柱装填得胜利吗？他是如何判别的？柱装填得胜利吗？他是如何判别的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶能否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶能否装填得均匀。此外，还可以参与大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖以参与大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，察看色带挪动的情况。假设色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色察看色带挪动的情况。假设色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色谱柱的性能良好。假设色谱柱出现纹路或是气泡，悄然敲打柱体谱柱的性能良好。假设色谱柱出现纹路或是气泡，悄然敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 假设凝胶色谱柱装填得很胜利、分别假设凝胶色谱柱装填得很胜利、分别操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；假设红色区带歪曲、散乱、变宽，阐明分出；假设红色区带歪曲、散乱、变宽，阐明分别的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。别的效果不好，