几丁质、 壳聚糖及其降解产物对巨噬细胞的作用

1、几丁质、 壳聚糖及其降解产物对巨噬细胞的作用                          作者：麻攀, 谭成玉, 白雪芳, 杜昱光 【摘要】  巨噬细胞是最重要的免疫细胞之一, 它既是免疫细胞, 又是辅佐免疫应答细胞, 它参与所有免疫效应细胞的产生、 动员、 活化和调节。本文中介绍了几丁质、 壳聚糖及其降解产物等对巨噬细胞

2、的作用, 以及它们的应用。 【关键词】  几丁质; 壳聚糖; 壳寡糖; 巨噬细胞; 细胞因子; 一氧化氮    几丁质是N乙酰葡糖胺（NAGA）经1, 4糖苷键连接的线性同源多聚体, 它广泛存在于昆虫、 甲壳类动物外壳及真菌、 酵母细胞壁及一些藻类中。壳聚糖是几丁质部分脱乙酰产物。很多实验证明几丁质和壳聚糖在提高免疫力、 抗肿瘤、 防治病原微生物等方面都有较明显作用, 现在人们又逐渐开始对其降解物几丁寡糖、 壳寡糖产生了兴趣。通过辐射法、 化学法或酶降解法等各种措施将几丁聚糖和壳聚糖水解即可得到几丁寡糖和壳寡糖。巨噬细胞广泛分布于机体的每个器官中, 在先

3、天性免疫和获得性免疫都扮演着重要角色。它可以直接杀伤病原体; 同时, 它还具有免疫调节功能, 与其他免疫细胞一起维持机体平衡与稳定, 是机体内最重要的免疫细胞之一。这里就对几丁质、 壳聚糖及其降解产物对巨噬细胞的作用作以综述。    1  对巨噬细胞产生NO的影响    Porporatto等1研究了壳聚糖对静息的和炎症激活的巨噬细胞中的精氨酸代谢途径的效应。他们认为在静息的巨噬细胞中, 低相对分子质量（Mr）的壳聚糖可适当激活并诱导的一氧化氮合成酶以及精氨酸代谢途径; 在炎症激活的巨噬细胞中, 通过壳聚糖的处理, 精氨酸酶

4、活性显著提高。用壳聚糖刺激的巨噬细胞的上清液能显著提高小鼠细胞系C6的增殖。从而说明了壳聚糖的愈伤活性可能是依赖于在伤处的炎症环境中增强的精氨酸酶活性。Jeong等2对高Mr水溶性壳聚糖WSC（watersoluble chitosan, Mr平均在300 000, 去乙酰化程度在90%以上）在RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的产生方面做了研究, 认为尽管以前证明了水不溶性的壳聚糖单独在体外对巨噬细胞一氧化氮产生有刺激作用, 然而, WSC单独却没有此作用。当WSC与重组的干扰素（rIFN）联合作用时, 则对一氧化氮的合成有明显的协作诱导效应, 并且有剂量依赖关系。用rIFN处理后24 h再加

5、入WSC对刺激一氧化氮合成效果最好。他们还指出, rIFN和WSC的协作主要是依赖于WSC诱导产生的TNF和NFB的激活。Hwang等3探讨了几丁质及其衍生物对激活的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的产生的作用。他们发现几丁质及其衍生物对于激活的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的产生有明显的抑制作用。6N乙酰壳六糖和五N乙酰壳五糖也能抑制NO的产生, 但没有几丁质及其衍生物那么明显。而N乙酰壳四糖、 三糖、 二糖以及几丁质的单体, N乙酰葡糖胺和葡糖胺对于激活的巨噬细胞一氧化氮产生却没有明显的作用。表明了几丁质物质在愈伤方面的作用可能与抑制了激活的巨噬细胞产生一氧化氮有关。Yu等4在研究中指出

6、, 壳寡糖能明显提高巨噬细胞诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）活性, 并诱导一氧化氮和TNF的产生。另外, 他们发现壳寡糖能提高核提取物中NFB的蛋白水平。当用特异性抑制剂阻断NFB时则会造成NO和TNF的减少。从而推测NFB在壳寡糖诱导巨噬细胞产生NO和TNF起到重要作用。Wu等5从壳聚糖的水解物中分离得到一种Mr 20 000的低分子量壳聚糖和壳寡糖混合物。然后进一步探讨了该壳聚糖水解物、 低分子量壳聚糖和壳寡糖混合物对RAW264.7巨噬细胞产生NO、 NFB的激活以及诱导型的一氧化氮合成酶的基因表达的影响。发现这3种物质单独都不会影响RAW264.7巨噬细胞产生NO, 而当壳聚糖水解物/

7、壳寡糖混合物与IFN联合作用时则会明显诱导NO的生成, 并呈现剂量依赖关系。而低Mr壳聚糖和IFN联合作用却抑制了NO的产生。他们认为壳聚糖水解物与壳寡糖混合物是促进了NFB迁入核内加强了其与DNA的结合活性, 从而促进了iNOS基因的表达而增强了NO的生成。Seo等6研究了水溶性壳聚糖低聚物（WSCO）对小鼠腹腔巨噬细胞NO合成以及巨噬细胞介导的对小鼠MethA纤维肉瘤细胞的细胞毒性的作用。WSCO本身对NO合成和杀伤肿瘤细胞没有作用, 但当用WSCO和IFN共同处理巨噬细胞时, 它们可以协同作用而提高一氧化氮的合成并促进对肿瘤细胞的杀伤。而这种协同作用主要是依赖于WSCO促进了肿瘤坏死因子

8、的分泌。    2  对巨噬细胞产生的细胞因子的影响    柯海萍等7将壳寡糖作用于体外培养的小鼠巨噬细胞, 运用RTPCR和ELISA技术, 发现壳寡糖能促进IL18基因的转录及翻译。Feng等8在研究中发现, 壳寡糖能刺激体外培养的巨噬细胞释放TNF和IL1。Han等9通过RTPCR测定TNF的转录水平来检测指出甘露糖受体可能是介导巨噬细胞吸收壳寡糖的受体。吴海明等10在实验中提出壳寡糖能促进巨噬细胞因子IL1、 TNF和IL18基因的表达, 而这些细胞因子又可以反馈激活巨噬细胞和NK细胞, 形成状的反馈调节关系, 从而

9、极大地增强机体的免疫功能和抗肿瘤能力。Chou等11探究了壳聚糖对脂多糖处理的RAW264.7巨噬细胞的环氧化酶途径以及细胞因子的产生的作用。他们指出壳聚糖明显抑制了PGE2的过量产生以及COX2蛋白的表达和活性, 同时一些促炎症因子, 如TNF和IL1的形成也被抑制, 但却加强了抗炎症因子IL10的形成。因此, 壳聚糖促进了伤口的愈合。Bianco等12指出从真菌细胞中提取的壳聚糖能够激活巨噬细胞且加强花生四烯酸的迁移, 并呈剂量和时间依赖关系。Fatiha等13认为壳聚糖可以作为一种基因输送物质, 他们对壳聚糖DNA纳米分子与THP1巨噬细胞的相互作用进行了探讨。在高量的纳米分子存在下仍然

10、检测不到有TNF、 IL1、 IL6和IL10的分泌, 但在处理24 h和48 h后在细胞上清液中金属蛋白酶9（MMP9）的分泌却明显提高了。因此, 他们认为, 壳聚糖DNA纳米分子与THP1巨噬细胞相互作用不能诱导促炎症因子的释放。活性MMP9在巨噬细胞中的出现可能是与纳米分子的吞噬作用和降解而不是炎症反应有关。1             3  对巨噬细胞糖受体的研究    Wu等5通过用抗CD14, 抗TLR4和抗CR3抗体处理RAW264.

11、7巨噬细胞发现可以明显阻断壳聚糖水解物/壳寡糖混合物与IFN联合作用对一氧化氮的促生成作用。提示壳寡糖混合物壳聚糖水解物中主要的功能组分, 与IFN协同刺激诱导NFB激活以及NO产生的作用是通过与RAW264.7巨噬细胞上CD14, TLR4和CR3受体结合而介导的。Feng等8通过激光共聚焦显示, 甘露糖能抑制巨噬细胞通过特异性受体介导的壳寡糖的内吞, 而脂多糖和葡聚糖则无此现象。他们还指出甘露糖BSA, 海藻糖BSA, 和N乙酰葡糖胺BSA是因为与壳寡糖竞争巨噬细胞上的带有甘露糖特异性的凝集素受体而抑制巨噬细胞对其的内吞。    4  在其他方面对巨

12、噬细胞的影响及应用    龚燕锋等14证明, 壳聚糖可以作为免疫佐剂提高对机体的免疫保护作用。Okamoto等15在研究中说明, 几丁质和壳聚糖的低聚物（NACOS和COS）能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞的迁移活性, 但多聚物, 几丁质和壳聚糖以及壳聚糖单体（GlcN）却没有。他们还通过研究小鼠巨噬细胞系（rMp）指出, 多聚物, NACOS和GlcN能明显增强rMp的迁移活性。Mori等16在研究中指出壳聚糖能够诱导腹腔巨噬细胞凋亡, 但是几丁质和可溶性低分子量壳聚糖却没有这个作用, 并且这种凋亡作用是通过Fas信号途径介导的。壳聚糖处理能够诱导如MHCI,

13、0; II,  Fc受体（FcRs）,  铁传递蛋白受体, 甘露糖受体, Fas, 以及巨噬细胞炎症蛋白(MIP)2等激活标记表达, 而几丁质和低分子量可溶性壳聚糖只能诱导MHCI,  II分子的表达, 从而说明壳聚糖可能是通过激活巨噬细胞来加速伤口愈合。曹秀明等17的实验表明壳寡糖在体外对HepG2、 BGC7901、 LS174这几株肿瘤细胞的生长没有明显的抑制作用, 说明壳寡糖没有细胞毒作用。同时体内实验证明了壳寡糖对小鼠S180实体瘤有显著的抑制作用。另外, 他们指出壳寡糖能够提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数, 说明壳寡糖对胸腺、 脾脏有较强的保护作用, 体

14、外实验中壳寡糖还能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力, 由此, 他们推断壳寡糖具有抗肿瘤细胞生长的作用, 其机制可能是壳寡糖对机体免疫力有保护和调节作用, 而不是直接对肿瘤细胞产生细胞毒作用。Reese等18指出, 几丁质能够诱导表达IL4的天然免疫细胞, 如嗜曙红细胞、 嗜碱细胞等在组织中的累积, 从而在过敏性反应以及寄生虫免疫中起到防御作用, 并且脊椎动物几丁质酶可以负面调控这种作用。Tanaka等19通过给小鼠口服和注射几丁质和壳聚糖对几丁质和壳聚糖的毒性进行了研究。他们指出每两周给小鼠腹膜内注射5 mg几丁质1次, 注射12周以上, 小鼠表观正常, 但在肠系膜中发现许多增生的巨噬细胞, 并且在脾脏中观察到大量多形核细胞。皮下注射5 mg几丁质也可观察到多形核细胞, 但没有发现其他变化。当腹膜内注射5 mg壳聚糖时, 小鼠的质量明显减少, 在第15周时此现象消失。用免疫组化的方法在肠系膜上观察到有很多增生的巨噬细胞。皮下注射5 mg壳聚糖没有引起动物体以及细胞的异常。口服5 mg壳聚糖导致了小鼠体质量下降, 同时也造成了小鼠肠道正常菌群中双歧杆菌和乳酸菌数量的降低。提示几丁质和壳聚糖在长期的临床使用上应该慎重对待。    5  结语 &