丹参药材水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱研究

1、2005年5月May 2005色谱Chi nese J our nal of Chromatogra phyVol.23No.3292295收稿日期:2004205231作者简介:周欣,女,教授,从事天然产物的分析研究,Tel :(08513806327,E 2mail :alice9800.基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(200126.丹参药材水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱研究周欣1,王道平1,梁光义1,张雪琴1,张中林2(1.贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室,贵州贵阳550002;2.贵州神奇制药有限公司,贵州贵阳550002摘要:采用高效液相色谱法(HPLC

2、对贵州铜仁丹参基地的丹参药材进行了指纹图谱研究。实验采用Zorbax SB 2C 18色谱柱(5m ,416mm i.d.×250mm ,以乙腈2014%(体积分数冰醋酸水溶液为流动相,乙腈的体积分数在70min 内由0线性增加到40%;流速110mL/min ;柱温25;检测波长254nm 。以19个主要共有峰为评价指标,采用国家药品监督管理局推荐的“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”计算处理,建立了铜仁地区丹参药材的HPLC 共有指纹图谱。该法操作简单,精密度、稳定性和重现性良好,有助于加强丹参药材的质量控制。关键词:高效液相色谱;水溶性成分;指纹图谱;丹参中图分类号:O 6

3、58文献标识码:A 文章编号:100028713(20050320292204S t u dy on Fi n ge rp ri nt Ch r o m a t og r a ms of Wa t e r 2S ol u ble Co ns t i t ue nt s of S a l vi a mi l t ior r hiza B ge.by Hi g hPe rf or m a nce L i q ui d Ch r o m a t og r ap h yZHOU Xin 1,WANG Daoping 1,L IANG Guangyi 1,ZHANG Xueqin 1,ZHANG Zho

4、nglin2(1.The K ey L abor ator y of Che mist r y f or Nat u r al Products of Guizhou Provi nce a n d The Chi nese Aca de my of Sciences ,Guiya ng 550002,Chi na ;2.Guizhou S henqi Pha r maceut ical Co.Lt d.,Guiya ng 550002,Chi n a A bs t r act :The finge rp rint chromatograms were establis hed for t h

5、e qualit y evaluation of S al vi a m il t ior r hiza Bge.by high performance liquid chromatograp hy.The analysis was pe rformed on a Zorbax SB 2C 18column (5m ,416mm i.d.×250mm wit h acetonit rile 2water (containing 014%(v/v acetic acid (t he volume f raction of acetonit rile f rom 0to 40%wit h

6、in 70min as mobile p hase at a flow rate of 110mL /min ,and at a column temperat ure of 25.The detection wave 2lengt h was 254nm.The relative standard deviations of relative retention values and relative peak areas were less t han 3%.The mutual finge rp rint of t he ext ract of S al vi a m il tior r

7、 hiza Bge.col 2lected f rom Dans hen Base in Tongren Cit y of Guizhou Province was establis hed by using t he simi 2larit y calculation sof tware of Chinese he rbal finge rp rint.The met hod is reliable and can be helpf ul in effectively cont rolling t he qualit y of S al vi a mil t ior r hiza Bge.K

8、ey w or ds :high pe rformance liquid chromatograp hy ;water 2soluble constit uents ;fingerp rint ;S al vi a m il tior r hiza Bge.中药丹参为唇形科植物丹参S al vi a mil t ior 2r hiza Bge.的干燥根及根茎,全国大部分地区均产。其性味苦、微温,具活血化瘀、安神宁心之功效1。其有效成分分脂溶性和水溶性两大类。水溶性成分有增加冠脉流量、抗心肌缺氧作用,同时还具有抗脂质过氧化、清除自由基、治疗慢性肾功能不全等作用2。由于其对心血管系统的特殊作用,已

9、被广泛应用于临床,但仍有很多研究单位继续探索丹参水溶性成分的新工艺制剂。为了掌握丹参水溶性成分制剂的质量,研究人员探讨了定量测定丹参中丹参素和原儿茶醛的方法3,4。但仅仅以丹参素和原儿茶醛的含量来评价丹参注射剂的质量是不全面的。张文生等5、杨文德等6、盛龙生等7、刘刚等8对丹参药材的不同提取组分及丹参注射剂进行了指纹图谱研究,为丹参的质量控制提供了部分科学依据。丹参品种、产地和采收期的不同会造成其成品质量的差异,为保证产品质量的稳定性,贵州铜仁地区建立了丹参种植基地,并采用中药材生产质量管理规范(GAP 管理方式进行管理。为了解基地药材的质量,我们按照国家药品监督管理局颁发的中药第3期周欣等:

10、丹参药材水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱研究注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行和中药注射剂色谱指纹图谱试验研究操作规程指南,采用高效液相色谱法(HPL C 对铜仁丹参药材基地的丹参药材进行了指纹图谱研究。1实验部分1.1仪器与试剂HP 1100高效液相色谱仪及Chemstation 色谱工作站;Zorbax SB 2C 18色谱柱(5m ,416mm i.d.×250mm ,SN :USCL 010524。乙腈为色谱纯(美国天地公司;水为新鲜乐百氏纯净水(过0145m 滤膜;冰醋酸为分析纯(上海化学试剂有限公司;丹参素钠(含量大于98%对照品由上海医科大学药学院天然药化室提供,原儿茶

11、醛购自中国药品生物制品检定所,批号为0810*;1#22#丹参药材均采自贵州铜仁丹参药材基地,由贵州神奇制药有限公司提供。1.2色谱条件以乙腈2014%(体积分数冰醋酸水溶液为流动相,梯度洗脱:乙腈的体积分数在70min 内由0线性增加到70%;流速110mL /min ;柱温25;检测波长254nm 。1.3实验方法对照品溶液配制:取经减压干燥过夜的丹参素钠、原儿茶醛对照品适量,用水定容作为对照品溶液(含丹参素钠01387g/L ,原儿茶醛01084g/L 。样品制备:称取丹参药材20g 粉碎,过40目筛,于60减压干燥2h 。精密称取约2g ,置于索氏提取器中,用100mL 水作提取溶剂,

12、提取16h 。将提取液过滤,放冷,定容,摇匀,即得供试品溶液。2结果与讨论2.1方法学考察精密度取7#药材样品制备供试品溶液,在“1.2”节色谱条件下,连续进样5次,色谱图中各色谱峰的相对保留值的相对标准偏差(RSD 小于0184%,色谱峰面积的RSD 小于1173%,采用国家药品监督管理局推荐的“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”(中南大学设计计算得5张色谱图的相似度为019以上,表明仪器精密度良好。重现性取1#药材样品5份制备供试品溶液,分别检测,色谱图中各色谱峰相对保留值的RSD 小于1119%,色谱峰面积的RSD 小于2132%,5张色谱图的相似度在019以上,表明方法的重现性良好

13、。稳定性取1#药材样品制备供试品溶液,分别在样品制备好后0,2,8,12,16,24h 进行测定,各主要色谱峰相对保留值的RSD 小于2143%,色谱峰面积的RSD 小于2176%,6张色谱图的相似度在019以上,表明供试品在24h 内稳定。2.2指纹图谱的建立及分析2.2.1丹参提取物指纹图谱的建立对12个丹参药材样品进行了测定,其色谱图有19个主要的共有特征峰(占总峰面积的90%以上,其典型的HPL C 指纹图谱见图1。其中1号峰和3号峰分别是丹参素和原儿茶醛(与对照品对照确认 。图1贵州铜仁丹参药材样品水提取物的指纹图谱(10#样品Fi g.1The f i n ge rp ri nt

14、c h r oma t ogr a m of t he ext r act of S a lvi a mi l t ior r hiza B ge.of No.10s a mple选择图1中3号峰(此峰为所有丹参样品所共有为参照峰,分别求出各特征峰的调整保留时间之比(相对保留值,和相对峰面积(峰面积之比,结果见表1。单峰面积与总峰面积的比值大于20%的共有峰只有14号峰,其值为2139;单峰面积与总峰面积的比值大于10%的共有峰有8号峰(值为1198和16号峰(值为2163。在12个丹参药材样品的水提取物中,3号、8号、14号和16号峰的峰面积比值误差范围是1(21414101(5158813

15、8(11853109。392色谱第23卷表112个丹参药材样品水提取物的特征峰的相对保留值和相对峰面积Ta ble 1Rel a tive rete nti on val ues (a n d rel a ti ve pea k a reas of c ha r acteris tic pea ks of t he ext r act of 12S a lvi a mi l t ior r hiza B ge.s a mplesPeak No.in Fig.1Relative peak areas of 12samples12345678910111210.680.370.500.380.59

16、0.570.390.390.410.410.580.540.6820.720.080.080.110.110.150.150.090.070.160.080.080.143111111111111141.170.140.110.160.120.110.160.120.130.170.110.120.1251.240.130.200.160.180.240.170.120.120.200.160.150.2161.740.740.630.680.610.560.640.970.800.640.600.630.6471.820.520.450.480.440.370.440.730.630.410

17、.440.450.4281.983.233.372.783.363.112.703.213.662.683.453.303.6492.040.160.340.140.330.410.160.240.220.190.380.310.34102.110.480.760.350.770.820.390.470.520.430.810.620.88112.170.591.050.421.191.200.440.740.940.401.181.031.36122.230.370.610.290.780.750.390.410.470.420.870.530.84132.300.300.400.190.6

18、80.640.240.390.370.240.620.461.04142.395.936.196.507.927.425.956.307.218.038.225.848.30152.570.190.300.130.430.440.150.280.310.360.450.320.57162.632.562.062.122.912.851.962.162.362.482.702.423.03172.850.270.590.270.520.630.320.300.360.340.590.520.49182.880.190.310.120.340.360.130.170.210.130.330.320

19、.43193.110.090.240.120.300.310.130.120.150.140.300.290.37 图2贵州铜仁丹参药材的共有指纹图谱Fi g.2Mut ual f i nge rp ri nt s of S alvi a mi l t ior r hiza B ge.f r om Guiz hou Ton gren a.average ;b.mid.2.2.2丹参水提取物的指纹图谱相似度分析指纹图谱的评价指标是供试品的指纹图谱与该品种的对照指纹图谱(共有模式及供试品之间指纹图谱的相似性。我们采用“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”对测定结果进行计算,得到丹参水提取物成分的

20、共有指纹图谱(见图2。对照共有指纹图谱,10个丹参药材样品水提取物的相似性分析结果见表2。表210个贵州铜仁丹参药材样品的相似性分析结果Ta ble 2Si mil a ri t y a nal ysis res ults of 10S a lvi ami l t ior r hiza B ge.s a mplesSample No.Correlationcoefficient (mid Correlation coefficient (average Congruence coefficient (mid Congruence coefficient (average 130.81490.8

21、6960.83190.8813140.99870.99320.99770.9928150.93750.96340.93060.9512160.99070.97480.99060.9762170.99280.97740.98770.9738180.96170.98120.96260.9794190.95550.98090.95940.9825200.96830.98870.97060.9894210.96590.98160.96130.9740220.98780.97030.98510.9692从表2可以看出,与共有指纹图谱相比,除13#样品外,其余9个样品的相似性均在90%以上,其中14#样品

22、的相似性在99%以上。为进一步了解13#样品与14#样品之间的差别,将两个样品的色谱图做直观比较(见图3。可以看出,两个样品中的14号峰与16号峰的相对峰面积差别较大,其中13#样品的14号峰和16号峰的相对峰面积分别是1170和0156,远远超出了这两个共有峰的相对峰面积误差范围。492第3期周欣等: 丹参药材水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱研究图313#样品(a 和14#样品(b 的H PL C 图谱Fi g.3Fi n gerp ri nt c h r oma t ogr a ms of No.13s a mple (a a n d No.14s a mple (b 3结论根据以上分析可

23、知,以简单测定一个或几个成分含量为主的传统的质量控制方法并不能真正反映中药材的质量,而宏观地综合分析植物药质量将成为必然。色谱技术测定指纹图谱具有综合、宏观的特点,为植物药的质量控制提供了一个有效方法。本工作在提取条件、色谱条件等方面都经过了大量的实验探索,所建立的方法精密度、稳定性和重现性符合指纹图谱研究的技术要求,也为丹参药材及其制剂的质量控制提供了部分科学依据。参考文献:1J iangsu New Medical College.Dictionary of Traditional ChineseMedicine ,Part 1.Shanghai :Shanghai Science and Technology Press (江苏新医学院.中药大词典,上册.上海:上海科学技术出版社,1986.4782Zhou Changxin ,Luo Houwei ,Niwa Masatake.J ournal ofChina Pharmaceutical University (周长新,罗厚蔚,丹羽正武.中国药科大学学报,1999,30(6:4113Dai Caiqin ,Yuan J ie.P