一种基于新型模式鱼卵黄蛋白原的水体环境雌激素污染检测方法

1、权利要求书1、一种用于检测海水环境雌激素污染的新技术，其特征在于它是以新型海水模式鱼种一海洋青婚鱼雄鱼(Oryziasmelastigma)为受试对象，采用生物学效应分析环境雌激素污染的污染程度。2、根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于采用同源克隆法，获取了海洋青端鱼卵黄蛋白原(VTG1)编码基因序列片段。3、根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于根据克隆得到的VTG1编码基因序列，设计VTG1荧光定量PCR引物(序列为：F:-TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3'R:5?-GGAMTGCAGGACACCCCAGTAGCC-3内参基因18S荧光定量PCR弓|物(序列为

2、：5,-AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3，R:-AGAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3'。4、根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于建立相对定量PCR法，分析环境样品诱导鱼卵黄蛋白原表达水平的差异。5、根据权利要求4所述的检测技术，其特征在于对海洋青鳍鱼进行环境样品暴露，并设立阴性和阳性对照，进行系统控制，评估样品的环境雌激素污染程度。2书摘要本发明属于环境检测领域，涉及一种基于新型广盐性模式鱼类卵黄蛋白原的水体环境雌激素污染检测方法。选择适应能力强的广盐性动物青鱼雄鱼(Oryziasmelastigma)作为活体模型。首先采用同源克隆法获得卵黄

3、蛋白原(vitellogenin,VTG)基因编码序列片段，设计引物，采用实时定量PCR方法检测VTG1的表达，并以18s核糖体RNA(18S)为内参基因，建立了VTG1转录水平的检测体系。第二，对雄鱼进行17-&雌二醇暴露和干净海水暴露，摸索合适的暴露时间，提取肝脏RNA,检测VTG1的表达量，分别作为阳性和阴性对照。第三，采集水样，进行暴露，分析VTG1的表达水平，从而分析水样的环境雌激素污染程度。说明书附图一种基于海洋青端卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法Anewmethodfordetectionofenvironmentaiestrogeninwaterbasedonthev

4、itellogenin1ofmarinemedakaoryziasmelastigma技术领域：本发明属于环境检测领域，涉及一种基于新型广盐性模式鱼类卵黄蛋白原的水体环境雌激素污染检测方法，可广泛运用于滨海城市内湖，河流入海口，海水等区域的环境雌激素检测。背景技术：目前，针对环境雌激素的污染问题主要采取的是化学检测的方法，如液相色谱和质谱联用法（HPLC-MS）等。这些方法的优点是灵敏度高，但这些方法所需的分析仪器价格昂贵，成本非常高，难以进行推广和普及。并且这些方法对样品的要求较高。环境样品与一般样品不同，具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度

5、低于现有方法的检出限或者样品复杂，机体干扰严重的情况下，直接测定是不可能的。与化学方法相比，生物检测可以避开成分检测，直接分析环境雌激素对健康的危害程度。但目前的生物检测法尚处于初始发展阶段，极少有海洋小型模式动物运用生物学检测。因而有必要开发基于海洋生物活体模型的检测技术，从海水的综合生物学和毒理学活性来直接评估海水污染的健康危害程度。我们选择了新兴模式生物-海洋青婚鱼。海洋青端（Oryziasmelastigma或Oryziasdancena,又名印度马达卡（Indianmedaka,黑点青解，原产于巴基斯坦、印度、缅甸和泰国沿海及淡水水域。在分类学上，海洋青鳍与日本青鳍同属脊索动物门辐鳍

6、鱼纲颗针鱼目怪颌第科青属。海洋青婚鱼作为近海海洋环境雌激素活体检测模型具有以下优势：1.体型较小，耐受力较强，很容易在实验室大规模饲养。2.性别差异可通过鱼鳍形态的不同而快速辨别，雌鱼产卵量大，世代周期短，繁殖代数多。3.对盐度的适应范围宽泛，可开发成有别于淡水斑马鱼模型的活体检测模型，在各种盐度的环境条件下进行推广应用。鱼类卵黄蛋白原特异性的产生于雌性动物肝脏中，正常条件下，雄鱼或者幼鱼体内很难检测到表达，但在雌二醇及环境类雌激素暴露下，雄性也会大量表达卵黄蛋白原。因而，雄鱼卵黄蛋白原的诱导可以指示环境中雌激素污染（Sumpter,J.P.andJobling,S.Vitellogenesi

7、sasabiomarkerforestrogeniccontaminationoftheaquaticenvironment.EnvironHealthPerspecto目前国内外已针对卵黄蛋白原开发出多种类雌激素检测方法，但所选择的鱼类模型均为淡水鱼类，包括鲤科和鲍科鱼类（如专利公开号：CN101519650和CN1763090）。通过查阅文献（中国期刊网、中华人民共和国专利局专利检索、ScienceDirect>ISIWebofScieneeSpringerJournal.NCBI,等)，未见海洋模式鱼类用于环境雌激素的检测方面的专利报道。本研究选用广盐性海洋青婚鱼作为活体模型，建立

8、了针对卵黄蛋白原的活体环境雌激素检测技术，具有高度的创新性和实用性。发明内容：本发明的目标是提供一种检测海洋环境雌激素污染的检测技术，并已运用于厦门内湖及周边海域的环境雌激素污染检测。本发明本发明首次将新型海洋鱼模式物种一海洋青婚鱼(Oryziasmelastigma)运用于海水环境雌激素污染检测。方法上采用实时荧光定量PCR方法，检测性成熟雄鱼卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG1)表达水平的变化情况，进而指示环境雌激素的污染。首先采用同源克隆法获得卵黄蛋白原基因编码序列片段，设计引物(序列为：F: 5-TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3R: 5-GGAAATGCAGG

9、ACACCCCAGTAGCC-3采用SYBR实时定量PCR方法检测VTG1的表达，并以18s核糖体RNA(18SribosomalRNA)为内参基因，建立了VTG1转录水平的检测体系，包括引物的设计，主要采用primer3.0和01igo6.0设计引物，并对引物的特异性和扩增效率进行分析，最终优化获得一对引物，序列如下：S: 5-AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3'T: 5GAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3，进一步优化PCR体系，最终确定为95r30秒预变性，95C5秒变性，60C20秒复性、延伸和收集荧光信号，40个循环。数据分析采用最大二阶导数

10、法分析，获得Ct值，采用2-法进行相对定量分析。第二，对雄鱼进行17-3-雌二醇(100ng/L)暴露和干净海水暴露，提取肝脏RNA,检测VTG1的表达量，分别作为阳性和阴性对照。第三，采集水样，进行三次平行暴露，分析VTG1的表达水平，与阳性和阴性对照组比较，从而分析水样的环境雌激素污染程度。具体实施过程如下：1 .样品采集与预处理在所需检测海域米集海水，米集表层下海水。米集的海水样品过夜澄清，米用虹吸法获得澄清海水，弃掉底部固体沉积物。2 .暴露实验选择3-4个月大的雄性海洋青端鱼为暴露对象，设立阳性和阴性对照。采用MilliQ水人工配置35%盐度的水样为阴性对照用水，加入100ng/L1

11、7-禺雌二醇，为阳性对照用水。设置三个平行样，每个平行样包含3条随机获取的雄鱼。采集样品与对照同时暴露，暴露时间为8小时，暴露期间无需喂食和换水。鱼暴露8小时后，捞出小鱼，用冰水浴处死鱼，解剖，获取肝脏组织，迅速收入-80C冰箱中保存。3 .鱼样品处理采用Trizol法提取RNA,分光光度法鉴定RNA质量和检测RNA浓度，取1pgRNA,采用Takara公司反转录试剂盒PrimeScript?RTMasterMix（DRR036A）反转录成cDNA,20p反应体系包含4八5XPrimeScriptRTMasterMix,10-100ng总RNA。程序为37E,15分钟；85C,5秒。反转录获得

12、第一链cDNA,用于下一步实验。（DRR081A）进行反应,20plPCR体系组分如下表:4.进行荧光定量PCR实验。在实时荧光定量PCR仪LightCycler?Roche480仪器上进行，采用Takara公司荧光定量试剂盒SYBR?PremixExTaqII试剂使用量（P）终浓度SYBR?PremixExTaqII10IX正向引物0.40.2pM反向引物0.40.2PMcDNA模板1<100ng无菌水8.2/程序两步法，具体为95C30秒预变性，95C5秒变性，60C20秒复性、延伸和收集荧光信号，40个循环。进行熔解曲线分析，确保只有目标产物扩增产生。采用最大二阶导数法分析，获得ct值，采用C法进行相对定量分析。以阴性对照组鱼的卵黄蛋白原表达量为参比值，计算暴露于样品的鱼卵黄蛋白原相对于阴性对照组的表达量。阳性对照组用于确认体系的正常运行，并为样品的环境雌激素污染程度提供定性认知。本发明能有效运用于海水样品的环境雌激素污染检测，为日益严重的海洋环境雌激素污染提供监测和预警技术。实例：采集厦门周边海域及内盐水湖一贯雪湖海水样品，进行污染检测。所采海水样品，包括赏雪湖、白城和轮渡码头。各