噬菌体展示技术操作步骤

1、试剂及配制LB培养基:胰蛋白月东酵母提取物(3)LB/IPTG/Xgal平板：1LLB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70c以下，加入1mlIPTG/Xgal,立即铺板，4c避光保存。(4)顶层琼脂糖凝胶:胰蛋白月东10g酵母提取物5gNaCl5gMgCl2.6H2O1g琼脂糖7g溶于适量去离子水中，至总体积为1L。高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。2XM9盐：Na2HPO412gKH2PO46gNaCl1gNH4Cl2g溶于适量去离子水中，至终体积为1L。(6)小型平板：500ml2XM9盐500ml3%琼脂粉20ml20%葡萄糖2ml1MMgSO40.1m

2、l1MCaCl21ml硫胺素(10mg/ml)在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70c以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于4o(7)封闭缓冲液：0.1MNaHCO3(PH8.6)5mg/mlBSA0.02%NaN3过滤除菌，储存于4C。(8)TBS:筛选多肽(2)NaCl溶于去离子水，至IPTG/Xgal:称取1.25gIPTG,5g1L,高压灭菌,4c保存。1.0gXgal,溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml,-20c避光保存。(1)10g5g50mMTris-HCl(PH7.5)150mMNaCl高压灭菌，室温储存。(9)PEG/NaCl:20%(w/v)聚乙二醇-8000

3、2.5MNaCl高压灭菌，室温储存。(10)碘化物缓冲液：10mMTris-HCl(PH8.0)1mMEDTA4MNaI室温避光保存。操作步骤：1 .第一天(1)以0.1MNaHCO(PH8.6)制备100科g/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。(2)在每孔内加入1.5ml靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润(这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠)。(3)在湿盒中，4c温和振荡孵育过位。4c保存于湿盒中备用。(4)二天(4)将ER2537(滴度测定时用来铺板的细菌培养物)接种至10mlLB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537

4、过夜培养物接种于含有20mlLB培养基的250ml锥形瓶中(比例为1:100)。37c剧烈振摇。(5)将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4c孵育至少1h。(6)去除包被液。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液(也可利用自动洗板机洗涤)。洗涤要迅速，避免平皿干燥。(注意每次更换纸巾，以避免交叉污染)。(7)用1mlTBST稀释4X1010噬菌体(10“原库)， 加至包被后的平皿内， 室温下轻缓摇动10-60min。(8)以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。(9)以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次

5、，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。(10)用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体(0.1-1mM)的TBS,或是含有靶蛋白(100g/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。(10a)或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸(PH2.2),1mg/mlBSA。轻缓摇动不超过10min,将洗脱液转入微量离心管中，以150dl1MTris-HCl(PH9.1)中和。(11)取小量洗脱液(1)测定滴度， 如果有必要， 可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序(见后续操作)。(未用的洗脱物可4c保存过夜，第二天

6、进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537,第二天，用LB培养基以1:100将该培养物稀释至20ml,加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37c剧烈振摇孵育4.5h,进入步骤13)。(12)将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20mlER2537培养物中(对数早期)，37c剧烈振摇孵育4.5h。(13)将培养物转入微量离心管中，4C,10000转离心10min,将上清转入新的离心管中，再次离心。(14)将80%勺上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。4c沉淀噬菌体至少60min或过夜。(5)第三天(15) 4C,10000转离心PEG勺沉淀物15min,倾去上

7、清，再次离心，吸去多余的上清。(16)用1mlTBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4c离心5min使残留的细胞沉淀。(17)将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4c离心10min,弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。(18)用200“TBS,0.02%NaN3悬浮沉淀物，离心1min,将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。(19)测定洗脱物在扩增后的浓度，贮存于4C。(20)包被平皿进行第二轮筛选，同步骤1-3。4 .第四天和第五天(21)计数蓝色噬斑，确定噬菌体的滴度，计算对应于1X10-2X1011pfu的噬菌体体积。如果

8、滴度太低，在筛选时可采用对应于109pfu的噬菌体体积。(22)进行第二轮筛选：重复步骤4-18,用含1X1011-2X1011pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选，将洗涤液中的Tween20浓度增至0.5%。(23)测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。(24)包被平皿进行第三轮筛选，步骤1-3。5.第六天(25)进行第三轮筛选：用第二轮扩增洗脱液中1X10”-2X1011pfu噬菌体进行筛选，洗涤日Tween20的浓度仍为0.5%。(26)测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。如果不进行第四轮筛选则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序：平板的孵育时间不得长于18h,因为时间过长

9、可能造成噬菌体感染率下降。将剩余得洗脱物保存于4C。(27)选取单克隆ER2537过夜培养。噬菌体滴度的测定材料和试剂(1)微波炉。(2)LB/IPTG/Xgal培养板。(3)LB培养基。(4)顶层琼脂糖凝胶。操作步骤(1)在5-10mlLB培养基中接种单个ER2537克隆，振摇孵育直至对数生长中期(ODO0=0.5)(2)在细胞生长时，微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml。维持在45c备用。(3)37c预热LB/IPTG/Xgal培养板，备用。(4)以LB培养基10倍比稀释噬菌体。建议稀释范围：对扩增的噬菌体培养上清，108-10；对未扩增的筛选洗脱液，101-104。每次

10、稀释都换用新的加样枪头，最好使用气溶胶阻隔枪头以避免交叉污染。(5)一旦ER2537培养物长至对数生长中期，分装至微量离心管中，每管200科l。(6)将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中，一支微量离心管中仅加入一种稀释液10(il,快速涡旋，室温孵育1-5min。(7)转移至含有45c顶层琼脂糖凝胶的管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的LB/IPTG/Xgal平板上，轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。(8)冷却平板5min,37c倒置培养过夜。(9)噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准，噬斑数乘以稀释度即可获得每101噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。噬斑的扩增材料和试剂(1

11、)恒温摇床(2)培养管(3)LB培养基(4)甘油操作步骤(1)以LB培养基稀释ER2537过夜培养物。1ml分装至培养管，每管中接种一个克隆。第三轮筛选后，每10个克隆就可能获得一个共同序列。(2)使用消毒牙签或枪头，穿刺噬斑，接种至上述培养管中。注意：要挑选噬斑数不超过100的平板上的噬斑，从而保证每一个噬斑仅包含单个DN际列。(3)37c振摇孵育4.5-5h(不能过长)。(4)可做可不做。除了测定单个克隆的序列，也可将筛选到的全部噬菌体进行测序，一步就可能获得12个残基中的共有序列。取10科l未扩增的洗脱物加至1ml宿主菌稀释液中37c振摇孵育4.5-5h。(5)将培养物转至微量离心管，离

12、心30s,取上清转入新的离心管中再次离心，取上部约80%勺上清转至新的离心管。这是扩增的噬菌体贮存液，能4c保存数周，若需长期保存，以无菌甘油1:1稀释后，-20C保存。测序模板的快速纯化材料和试剂(1)真空泵(2)PEG/NaCl溶液(3)碘化物缓冲液(4)70%L醇(5)TE缓冲?10mMTris-HCl,PH8.01mMEDTA操作步骤(1)扩增噬斑(见上述)，在第一次离心后，将500dl含有噬菌体的上清转入新的离心管中。(2)加入200dlPEG/NaCl,颠倒混匀，室温静置10min。(3)离心10min,倾去上清。(4)再次短暂离心，仔细吸去残留上清。(5)用100dl碘化物缓冲液

13、完全重悬沉淀物， 加入250“乙醇。 室温孵育10min,室温短暂孵育将选择性沉淀单链噬菌体DNA而大部分噬菌体蛋白保留在溶液中。(6)离心10min,倾去上清，用70%L醇洗涤沉淀物，真空吸干。(7)用30“TE缓冲液重悬沉淀物。(8)取5作为测序模板，或根据需要增减。ELISA检测筛选到的靶分子结合肽材料和试剂(1)酶标板，酶标仪。(2)湿盒。(3)吸水纸。(4)LB培养基。PEG/NaCl。(6)TBS0.1MNaHCQ(PH8.6)。(8)HR麻物缓冲液。ABTS贮存液：在100ml50mM勺柠檬酸钠溶液(PH4.0)中溶解22mgABTS过滤除菌贮存在4C。操作步骤(1)噬斑扩增上清

14、部分用于DNA列测定，其余保存于4C。(2)将ER2537接种至20mlLB培养基中，37c孵育至轻微混浊，或将过夜培养的ER2537按1:100稀释至20ml。(3)加入5科l噬菌体上清，37c剧烈通气培养4.5h。(4)将培养物转入离心管，10000转离心10min。取上清转入新的离心管，再次离心。(5)吸取上层80%勺上清转入新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl,4c沉淀1h或过夜。(6)4C,10000转离心PEGM淀物15min。倾去上清，再次短暂离心，吸去残留上清。(7)用1mlTBS悬浮沉淀物，并转至微量离心管中，4c离心5min以沉淀残留细胞。(8)将上清转至新离心管中

15、，再次用1/6体积的PEG/NaCl沉淀噬菌体。冰上孵育15-60min,4c离心10min。倾去上清，再次短暂离心，吸去残留上清。(9)用50“TBS悬浮沉淀物。测定滴度，贮存于4C。(10)取100-200“溶于0.1MNaHCPH8.6)的100g/ml靶蛋白包被酶标板的加样孔，在密封的湿盒内4c孵育过夜。每一个克隆包被一列。(11)倾去靶溶液，并将板子反扣在吸水纸上尽量吸干。在每一个孔中加满封闭缓冲液。另外，每个克隆都需要封闭一列未包被的加样孔，以检测其与BSA包被板子的结合。封闭另一个酶标板用来稀释噬菌体，这样可以保证稀释过程中噬菌体不被靶蛋白吸收。4c封闭1-2h。(12)倾去封闭液，用1(TBS/Tween洗涤板子6次，每次都将酶标板反扣在吸水纸上尽量吸干。Tween的浓度应该与筛选洗涤步骤的浓度相同。(13)用TBS/Tween4倍比稀释噬菌体，200“/孔，第一孔为1012颗粒，第十二孔为2乂105颗粒。(14)用多道加样枪，将每一列倍比稀释的噬菌体转至靶蛋白包被的酶标板内。室温振荡孵育1-2h。(15)用1xTBS/Tw