第10章合子胚培养-副本

1、第第10章章 合子胚培养合子胚培养v1 合子胚培养的概念合子胚培养的概念v1.1 植物胚胎培养的概念植物胚胎培养的概念v植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。的技术。 1.2 合子胚培养的概念合子胚培养的概念v合子胚培养是指在无菌条件下分离和培养有合子胚培养是指在无菌条件下分离和培养有性胚，以期获得可育植株的一种技术。性胚，以期获得可育植株的一种技术。v1904年，年，Hannig最早在无菌条件下进行了离最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验（辣根菜和胡萝卜的成熟胚）。体胚培

2、养实验（辣根菜和胡萝卜的成熟胚）。v依靠合子胚培养技术，现在已经能够挽救早依靠合子胚培养技术，现在已经能够挽救早熟败育的杂种胚。熟败育的杂种胚。 2 胚培养的类型胚培养的类型v2.1 成熟胚培养成熟胚培养v培养基和培养条件：培养基和培养条件：培养基只需含无机盐和糖即可；提供合适的生长条件及打破休眠。v培养技术：培养技术：成熟胚培养技术也要求不严v操作：操作：受精后的果实或种子（带种皮） 表面消毒 剥离种胚 培养 完整植株。v发育途径：发育途径：主要是直接形成幼苗 2.2 幼胚（未成熟胚）培养幼胚（未成熟胚）培养v幼胚指的是尚未成熟即发育早期的胚。v特点：特点：v培养困难，对培养基的要求复杂v对

3、培养技术和培养条件的要求较高v幼胚培养发育途径：幼胚培养发育途径：v（1）继续正常的胚胎发育过程，维持胚性生长，最终形成具有萌发能力的成熟胚。v进行幼胚培养时，关键是维持胚性生长（此途径为需要途径）。为了保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育，其对营养的需求较成熟胚复杂。v（2）不能维持胚性生长，迅速萌发为幼苗。v幼胚未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼幼胚未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象称为苗的现象称为“早熟萌发早熟萌发”(precocious germination，不需要不需要)。v（3）形成愈伤组织。v若形成愈伤组织，愈伤组织可再分化形成植株。3 合子胚培养的技术措施合子胚培养的

4、技术措施v3.1 材料的选择与灭菌（材料的选择与灭菌（p157）v（1）幼胚培养）幼胚培养 v选材：选材：因植物类型及实验目的的不同而不同v表面消毒：表面消毒：对受精后子房进行表面消毒v（2）成熟胚培养：）成熟胚培养：取成熟的果实或种子进行表面消毒，再分离胚进行和培养。 3.2 胚的分离及培养胚的分离及培养v3.2.1 胚的分离胚的分离v成熟胚的剥离：较容易成熟胚的剥离：较容易v幼胚的剥离幼胚的剥离（p157158）：）：v表面消毒表面消毒 切开子房壁切开子房壁 取出胚珠取出胚珠 剥离珠被剥离珠被 取出完整幼胚取出完整幼胚 培养培养3.2.2 胚的培养胚的培养v成熟胚的培养：成熟胚的培养：v只

5、需提供合适的生长条件及打破休眠，即可只需提供合适的生长条件及打破休眠，即可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。故培养基只需含无机盐和糖即可。故培养基只需含无机盐和糖即可。v另外，成熟胚培养技术也要求不严。另外，成熟胚培养技术也要求不严。v未成熟胚的培养：未成熟胚的培养：要求的技术和条件较高。v胚胎发育过程可分为两个时期：异养期异养期和自养自养期期。胚由异养转入自养是其发育的关键时期。在这两个时期之内，培养中的胚对外源营养的要求随胚龄的增加而逐渐趋向简单（p153，表9.1） 。v在人工培养基上幼胚培养难成功，利用胚乳看胚乳看护培养（为什么？）护培养（

6、为什么？），可显著提高幼胚的成活率。可用同种胚乳，也可用异种胚乳（p159）。 4 影响胚培养的因素影响胚培养的因素v4.1 培养基培养基v4.1.1 无机盐无机盐v用于胚培养的无机盐配方很多，对其中每种用于胚培养的无机盐配方很多，对其中每种成分的作用并无精确的评价。成分的作用并无精确的评价。 v成熟胚培养中，主要采用一些较简单的培养成熟胚培养中，主要采用一些较简单的培养基，如基，如Tukey、Randolph、White等。等。v幼胚培养的培养基主要有幼胚培养的培养基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、White、Rangaswang、Norstog等。等。 v根据根据Monnie

7、r(1976)的研究，在一定的培养的研究，在一定的培养基上，基上，未成熟胚的生长和存活之间并不存在未成熟胚的生长和存活之间并不存在相关性相关性（p161，图，图9.4），并设计了新的培），并设计了新的培养基（养基（ p154155，表，表9.3 ）。）。v另据另据Umbeck和和Norstog(1979)报道，培养报道，培养基中的基中的NH4对于大麦未成熟胚的正常生长对于大麦未成熟胚的正常生长和分化是必需的和分化是必需的。4.1.2 碳水化合物和培养基的渗透压碳水化合物和培养基的渗透压v种类：种类：蔗糖最好蔗糖最好v浓度：浓度：因胚的发育时期而有所不同。成熟胚因胚的发育时期而有所不同。成熟胚在

8、含在含2蔗糖的培养基中就能很好生长；幼胚蔗糖的培养基中就能很好生长；幼胚则要求较高水平的糖浓度（一般为则要求较高水平的糖浓度（一般为812 ），如果浓度过低，会引起幼胚过早萌发。），如果浓度过低，会引起幼胚过早萌发。v在长期的培养过程中，随着培养时间的增加，在长期的培养过程中，随着培养时间的增加，必须把胚转移到蔗糖水平逐步降低的培养基必须把胚转移到蔗糖水平逐步降低的培养基中。中。v蔗糖不仅是作为一种能源，而且是为了蔗糖不仅是作为一种能源，而且是为了保持保持适当的渗透压适当的渗透压，后者对于未成熟胚的培养来，后者对于未成熟胚的培养来说尤为重要。说尤为重要。 v另有观点认为，胚在离体条件下的生长和

9、分另有观点认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。4.1.3 氨基酸和维生素氨基酸和维生素v在胚培养中加入氨基酸，无论是单一的还是在胚培养中加入氨基酸，无论是单一的还是复合的，都能刺激胚的生长。加单一氨基酸复合的，都能刺激胚的生长。加单一氨基酸时，以时，以谷氨酰胺谷氨酰胺最有效。最有效。 水解酪蛋白水解酪蛋白(CH)是是一种氨基酸复合物，一直被广泛用于胚培养。一种氨基酸复合物，一直被广泛用于胚培养。胚对水解酪蛋白的敏感性因物种而异胚对水解酪蛋白的敏感

10、性因物种而异。v常用于胚培养的维生素类有硫胺素、吡哆醇、常用于胚培养的维生素类有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚培养是必需的，但对已萌发生长的胚，可能培养是必需的，但对已萌发生长的胚，可能对其形态发生有抑制作用。对其形态发生有抑制作用。 4.1.4 植物生长调节剂植物生长调节剂v除了在某些植物中为了打破休眠以外，除了在某些植物中为了打破休眠以外，没有没有证据表明离体的成熟或未成熟胚的正常发育证据表明离体的成熟或未成熟胚的正常发育需要外源生长调节物质。需要外源生长调节物质。实际上，生长素对实际上，生长素对于胚的生长通常表现抑制作用。于胚

11、的生长通常表现抑制作用。 v如果为了由胚和胚段诱导愈伤组织，则通常如果为了由胚和胚段诱导愈伤组织，则通常都须在培养基中加入生长素或细胞分裂素，都须在培养基中加入生长素或细胞分裂素，或二者都加。或二者都加。4.1.5 天然有机物天然有机物v正常植物体上，胚的生长受胚乳滋养，因此，正常植物体上，胚的生长受胚乳滋养，因此，加入一些天然的加入一些天然的胚乳或种子提取物胚乳或种子提取物，对离体，对离体胚的生长有促进作用。某一植物的胚乳组织胚的生长有促进作用。某一植物的胚乳组织提取物对该植物胚的生长较好。提取物对该植物胚的生长较好。 v其它如椰子汁其它如椰子汁 、番茄汁等有较好效果。番茄汁等有较好效果。4

12、.1.6 培养基的培养基的pHv培养基的培养基的pH对胚的培养也有一定的影响。对胚的培养也有一定的影响。v例子：例子：如荠菜离体胚在如荠菜离体胚在pH值为值为5.47.5的培的培养基中都能正常生长。对紫花曼陀罗心形早养基中都能正常生长。对紫花曼陀罗心形早期的胚培养最适期的胚培养最适pH值在值在5.07.5的范围内。的范围内。8日龄的水稻胚在日龄的水稻胚在pH值值5和和9时，生长最好。时，生长最好。Norstog和和Smith(1963)报道，培养基的报道，培养基的pH值对于大麦未成熟胚的器官分化是关键因素，值对于大麦未成熟胚的器官分化是关键因素，最适值约为最适值约为4.9。4.2 培养条件培养

13、条件v4.2.1 温度温度v大多数植物胚培养的温度为大多数植物胚培养的温度为2530，但也，但也有些植物需要较低或较高的温度。有些植物需要较低或较高的温度。如：如：v马铃薯：马铃薯：20；香子兰；香子兰(Vanilla fragrans) ：3234；柑橘、苹果、梨：；柑橘、苹果、梨：2530；棉；棉花：花：32；桃：胚培养需在变温条件下进行；桃：胚培养需在变温条件下进行4.2.2 光照光照v由于胚在胚珠内的发育是不见光的，所以一由于胚在胚珠内的发育是不见光的，所以一般认为般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜，光对胚胎发育有轻微的抑制作用。光对胚胎发育有轻微的抑制

14、作用。v离体培养条件下进一步发育的幼胚对光的需离体培养条件下进一步发育的幼胚对光的需求，因植物种类而异。求，因植物种类而异。4.3 胚柄胚柄v胚柄的形态结构：胚柄的形态结构：p158，图，图9.1v有关胚柄的结构、细胞学和生理生化的详细有关胚柄的结构、细胞学和生理生化的详细研究表明，研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育过程。胚柄积极参与幼胚的发育过程。v有研究指出在幼胚培养中，有研究指出在幼胚培养中，胚柄的存在对幼胚柄的存在对幼胚的存活是关键胚的存活是关键。v使用生长调节物质，如使用生长调节物质，如5mgL赤霉素能有赤霉素能有效地取代胚柄的作用。当没有胚柄存在时，效地取代胚柄的作用。当没有胚柄存在

15、时，一定浓度范围的一定浓度范围的KT可促进幼胚的生长，但其可促进幼胚的生长，但其作用难与赤霉素相比。作用难与赤霉素相比。 v但但Monnier(1978)的观点是，无胚柄的极幼的观点是，无胚柄的极幼龄胚所以难于培养，是由于在除掉胚柄时所龄胚所以难于培养，是由于在除掉胚柄时所引起的损伤造成的。引起的损伤造成的。5 胚培养的应用胚培养的应用v5.1 通过通过“胚拯救胚拯救”获得远缘杂种获得远缘杂种v通过通过“胚拯救胚拯救” 即可克服这种受精后障碍，即可克服这种受精后障碍，产生远缘杂种。产生远缘杂种。v“胚拯救胚拯救”的方式有三种：的方式有三种：5.1.1 杂种幼胚在人工培养基上培养杂种幼胚在人工培

16、养基上培养v在发生在发生“受精后障碍受精后障碍”的情况下，若把杂种的情况下，若把杂种胚在开始夭折之前剥离出来，置于一种适当胚在开始夭折之前剥离出来，置于一种适当的人工培养基上培养，则杂种胚常常表现出的人工培养基上培养，则杂种胚常常表现出正常生长的潜力，最终长成杂种植株正常生长的潜力，最终长成杂种植株（p172）。）。v例子：草木犀、百合、车轴草属、稻属植物、例子：草木犀、百合、车轴草属、稻属植物、番茄等番茄等v如果胚的夭折发生在发育的极早期，由于人如果胚的夭折发生在发育的极早期，由于人工培养基很难取代天然胚乳的作用，采用以工培养基很难取代天然胚乳的作用，采用以上方法拯救杂种仍会遇到很大困难，在

17、这种上方法拯救杂种仍会遇到很大困难，在这种情况下，则可尝试胚乳看护培养法（情况下，则可尝试胚乳看护培养法（p172173）。）。5.1.2 杂种幼胚的胚乳看护培养杂种幼胚的胚乳看护培养v在以上两种方法皆难奏效的情况下，则可尝在以上两种方法皆难奏效的情况下，则可尝试杂种幼胚愈伤组织培养法，即先把杂种幼试杂种幼胚愈伤组织培养法，即先把杂种幼胚诱导成愈伤组织，经过或长或短的继代培胚诱导成愈伤组织，经过或长或短的继代培养之后，再诱导杂种愈伤组织分化植株养之后，再诱导杂种愈伤组织分化植株（p173） 。5.1.3 杂种幼胚的愈伤组织培养杂种幼胚的愈伤组织培养v步骤：步骤：有性杂交有性杂交 杂种幼胚培养杂

18、种幼胚培养 杂种愈杂种愈伤组织形成伤组织形成 愈伤组织增殖愈伤组织增殖 茎芽分化茎芽分化 植株再生植株再生v例子：小麦例子：小麦簇毛麦簇毛麦 、大麦、大麦小麦、栽培番小麦、栽培番茄茄智利番茄等智利番茄等 5.2 获得单倍体获得单倍体v在远缘杂交之后，通过染色体的定向消除而在远缘杂交之后，通过染色体的定向消除而产生单倍体，是胚培养的另一项新用途产生单倍体，是胚培养的另一项新用途（p175）。）。 v例子：栽培大麦例子：栽培大麦球茎大麦球茎大麦5.3 打破种子休眠，缩短育种周期打破种子休眠，缩短育种周期v许多植物的种子发育不完全或有抑制物存在许多植物的种子发育不完全或有抑制物存在而影响种胚发芽。而通过幼胚培养，可促使而影响种胚发芽。而通过幼胚培养，可促使这些植物的