影响分光光度法检测藻类叶绿素a的因素_赵玉华

1、收稿日期:2006-08-10基金项目:辽宁省水利厅项目(05-08-37作者简介:赵玉华(1959-,女,教授,主要从事水处理理论与技术研究.文章编号:1671-2021(200703-0482-03影响分光光度法检测藻类叶绿素a 的因素赵玉华,刘 畅,薛 飞,傅金祥(沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁沈阳110168摘 要:目的为检测藻类叶绿素a 提供可借鉴的依据.方法采用玻璃离心管与塑料离心管,待测液样在分光光度计中稳定不同时间,在叶绿素a 提取过程中对液样加以冷藏的方法,进行对比试验.结果塑料离心管测得的水样叶绿素a 值,比用玻璃离心管测得的值平均高30.1%.液样在分光光度计中稳定

2、时间05m in 内,叶绿素a 值随稳定时间延长而提高,5m in 以后提高速度减缓.冷藏时间在6h 以内,叶绿素a 值平均增加1.92L g #(L #h-1,6h 以后,叶绿素a 值增加速度减缓.结论塑料材料对叶绿素a 值测定有干扰作用,采用塑料离心管测得的水样叶绿素a 值偏高,建议用玻璃离心管.待测液样在分光光度计中的稳定时间对藻类叶绿素a 值的测定有影响,如果稳定时间过短,会使测定结果偏低.适合的稳定时间为1020min,在叶绿素a 提取过程中,将液样适当进行冷藏,可使叶绿素a 充分溶解于溶液中,适合的冷藏时间为68h,供分光光度法检测藻类叶绿素a 参考.关键词:藻类;叶绿素a;分光光

3、度法检测;离心管材料中图分类号:X832 文献标识码:A 水中藻类过量繁殖会使水透光性差,影响水生物生长繁殖1.产生藻毒素,危害生物及人类健康2-4.水中藻类的检测通常采用叶绿素a 法和显微计数法5-8.国家环境保护局公布的5水和废水监测分析方法6中规定,叶绿素a 的检测采用分光光度法9.在试验过程中发现,规定的操作过程与步骤不尽详细,使得试验结果会产生一定的误差.比如,水样离心所用的离心管材料、测定吸光度时待测液样在分光光度计中的稳定时间等,都未做说明.因而,笔者进行了离心管材料、待测液样稳定时间和叶绿素a 提取过程中加以冷藏的对比试验,为藻类叶绿素a 的检测提供可借鉴的依据.1 试验方法1

4、11 试验仪器设备抽滤装置(2XZ-0.5型旋片真空泵,过滤器,直径35mm 、0.45L m 微孔滤膜(混合纤维,小研钵(配套研杵,台式离心机,冰箱,9100可见光分光光度计.112 试验用水试验用原水取自沈阳建筑大学人工湖.该湖于2003年注入地下水,其作用除用做校园景观外,还兼养鱼类.由于湖水流动性较差,光照充足,以及投放鱼食等营养物质,造成藻类繁殖,主要以蓝藻为主,湖面水呈绿色,处于富营养化状态.夏季最高水温在26e 左右,浊度4.0 6.0NTU,高锰酸盐指数的质量浓度8.229.45m g #L -1,pH 值6.55左右.113 水样采集因为藻类基本接近水面的浅层水中生长繁殖1,

5、而且受光照条件和水温影响,因而,每天在同一时间,同一地点,同一液面深度下采集原水水样.114 叶绿素a 测定过程水样用滤膜过滤后,将滤膜放在匀浆器或小2007年05月第23卷第3期 沈阳建筑大学学报(自然科学版Journal of Shenyang Jianzhu U niversity (N atural ScienceM ay 2007V ol 123,No 13研钵内,加90%的丙酮溶液23m L,充分研磨,提取叶绿素a,并将浆液移入离心管中,放入冰箱冷藏一定时间,以使叶绿素a充分提取出来,温度保持在4e.提取完毕后,以3500r/m in转速离心分离10min.重复提取过程(不需再冷藏

6、和离心过程1次.将浆液移入比色皿内,放入分光光度计稳定一定时间,分别在750nm、663nm、645 nm、630nm波长下测提取液的吸光度.用下式计算叶绿素a值.Q(叶绿素a=11.64(OD663-OD750-2.16 (OD645-OD750+0.1(OD630-OD750式中,OD为吸光度.在叶绿素a测定过程中,还需要注意以下几点.(1在将离心管放入离心器中进行离心时,要注意离心管对称放置,譬如:1-3-5,2-4- 6.否则,会引起离心不均匀,同时会对离心器产生一定的破坏.(2在进行水样抽滤时,需注意抽滤压力不高于相当150mm汞柱的压力,否则,过大的压力会破坏藻细胞,从而带来叶绿素

7、a测值的失真10.并且抽滤要在一个避光性好的室内操做,并尽快完成,避免将叶绿素暴露在不必要的光中.2试验结果讨论211离心管材料的影响分别采用塑料离心管和玻璃离心管,对水样提取液进行离心分离,以探讨离心管材料对测定结果的影响.测得的叶绿素a值如图1所示.从图中可以看出,采用塑料离心管测得的水样叶绿素a值,始终高于同样条件下采用玻璃离心管测得的叶绿素a值,误差在21.0%43.6%之间,平均误差30.1%.说明塑料离心管与提取液中的成分发生了某种化学反应,严重干扰了叶绿素a值的测定结果.因为丙酮对塑料具有腐蚀性,因此,在离心分离过程中,含有丙酮的提取液溶入了离心管材料成分,使测定结果偏高.212

8、稳定时间的影响将盛有待测溶液的比色皿放入分光光度计中,在不同的稳定时间下读取吸光度,以确定适合的稳定时间.测得的水样叶绿素a值见图1.从图1中可以看出,叶绿素a随着稳定时间的延长而增大.在05m in时段,叶绿素a值变化幅度较大,相差49.4%;525min时段,叶绿素a值变化幅度减小,差值在5%以下,逐渐趋于稳定.但由于丙酮具有挥发性,如果稳定时间过长,一旦被检测液的液面高度低于比色皿高度的2/3,也会使测定结果准确度下降 .图1叶绿纱a值与离心管材料和稳定时间关系213冷藏时间的影响在叶绿素a提取过程中,采用不同冷藏时间进行对比,以使叶绿素a能完全从藻细胞中分离出来,进入溶液中.将过滤后的

9、滤膜加丙酮溶解,然后将水样转移到离心管中,外部罩上避光物放入冰箱内,开始计时,到将离心管从冰箱中取出的时刻结束,这段时间定义为冷藏时间.温度保持在4e.不同冷藏时间条件下测得的叶绿素a值见图2.在冷藏时间为06h时段,随着冷藏时间的延长,叶绿素a值提高很快,从15.27L g#L-1增至24.85L g#L-1,增加67.7%,平均增加1.92L g#(L#h-1;在624h时段,增长趋势变缓,增加7.44%,平均增加0.10L g#(L#h-1,叶绿素a值基本趋于稳定 .图2叶绿素a值与冷藏时间的关系3结论(1由于塑料材料对叶绿素a值测定有干扰作用,采用塑料离心管测得的水样叶绿素a值偏高,建

10、议采用玻璃离心管进行含水藻类叶绿素a 值测定的离心操作.第23卷赵玉华等:影响分光光度法检测藻类叶绿素a的因素483(2待测液样在分光光度计中的稳定时间对藻类叶绿素a值的测定有影响,如果稳定时间过短,会使测定结果偏低.建议稳定时间至少5 min,适合的稳定时间为1020min.(3在叶绿素a提取过程中,将液样适当进行冷藏,可使叶绿素a充分溶解于溶液中,随着冷藏时间的延长,测定的藻类叶绿素a值增加.适合的冷藏时间为68h.参考文献:1黄萌.富营养化对水生生态系统的污染生态效应J.科技情报开发与经济,2006,16(20:137-138.2Paer l H W,Fulton RS3rd,M ois

11、ander P H,et al.Harmful freshw ater algal blooms,with an emphasison cyanobacteriaJ.Scientific Wor ld Journal,2001,4(1:76-113.3Duy T N,Lam P K S,Shaw G R,et al.T ox icologyand risk assessment of fresh-water cyanobacterial(blue-g reen algaetox ins in w aterJ.Rev Env ironContam T ox icol,2000(163:113-1

12、86.4Zhang M M,Pan U,Yan H,et al.A met hod to ex-tract algae tox in of microcystin-LRJ.Env ironSci.(China,2004,16(4:694-696.5Gregor J,M arsalek B.F reshw ater phytoplanktonquantification by chlo rophyll-a:a comparative studyof in v itro,in viv o and in situ methodsJ.Water Re-search,2004,38(3:517-522.

13、6P into A,V on Sper ling E,Mor eor a R.Chlorophy ll-adetermination via continuous measurement of plank-ton fluor escence:methodology developmentJ.WaterResearch,2001,35(16:3977-3981.7贺小芮,周俊杰.倒置显微镜计数法检测浮游藻类J.中国给水排水,2004,20(11:98-100.8韩桂春,谷丰,张忠臣.淡水中叶绿素a测定方法的探讨J.中国环境检测,2005,21(1:55-57. 9国家环境保护局,5水和废水监测分

14、析方法6编委会.水和废水监测分析方法M.北京:中国环境科学出版社,2002.10张新,刘洪林,王素芬.分光光度法测定叶绿素a含量的方法探讨J.山东水利,2002(3:39-40.Test of Factors Influencing Chlorophyl-l a in Water Algal bySpectrophotometryZH A O Yuhua,L I U Chang,X UE Fei,F U Jinx iang(School of M unicipal and Environmental Engineering,Sheny ang Jianzhu U niv ersity,Shen

15、yang110168,ChinaAbstract:In the paper chlorophyl-l a in water algal is measured by spectrophotometry.Glass centrifuge tube and plastic centrifuge tube are used for separateing algal from w ater.The fluid sam ple is deepfrozen in re-frigeratory under4e for different time during separating chlorophyl-

16、l a from algal.After the fluid sample is put in spectrophotometer for different time,w hich is called stabilization time,the absorbency of the sample is taken.The test result indicates that chlorophyl-l a of fluid sample measured through plastic centrifuge tube is averagely hig her by30.1%than glass

17、 tube because of plastic disturbance.If stabilizing for less than5 minutes chlorophyl-l a of fluid sample increases rapidly along w ith stabilization time increasing.If stabilizing for more than5minute chlorophyl-l a increases very slow ly,so the suitable stabilization time is5minutes to 10minutes.If deepfreezing for less than6hours chlorophyl-l a of fluid sample increases averagely by1.92L g per litre