核酶细胞内抗丙型肝炎病毒作用的研究

1、    核酶细胞内抗丙型肝炎病毒作用的研究         【摘要】目的研究核酶抗丙型肝炎病毒(HCV)的有效切割位点并获得高效、特异、无毒、价廉的HCV特异性 反式核酶。方法根据文献报道的序列设计、合成HCV 5非结构(NC)区和核心(C)区 的特异性反式核 酶基因并分别克隆进入真核细胞表达载体pSV2-gpt.CD-SR中，转染HCV感染的MT-2细胞 ，用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、核酸杂交等方法测定核酶对HCV的抑制作用。结果所用的HCV 5NC区核酶和

2、C区核酶对HCV均有显著的抑制作用，抑制 率分别为54.7%和62.1%。两者联合作用时抑制率达78.8%。结论HCV 5NC区和C区特异性反式核酶在HCV感染的体外细胞培养模型中 对HCV复制有明显的抑制作用；双靶位核酶联合使用较单靶位核酶效果更好。【关键词】核酶；肝炎病毒，丙型；MT-2细胞An in vitro study of ribozyme against hepatitis C virusCHEN ZhiLIU YongLIU Kezhouet al.（The Institute of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital,

3、 Medic al College, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China）【Abstract】Objective To determine the cleavage sites of ribozymes against hepatitis C virus(HCV), and to obtain a highly effective, nontoxic and inexpensive antisense ribozyme specific for HCV.Methods Two effective ribozymes, targeted to

4、HCV 5-non-coding region(5-NCR) and C region, were synthesized. Eukaryotic expression vectors, pSV2-gpt. CD-SR, containing either HCRZ NC or HCRZC were constructed and transfected into MT-2 cells, which had been in fected by HCV. Quantitative RT-PCR and hybridization methods were used to deter mine t

5、he effect of inhibition of HCV by ribozymes.Results HCRZNC and HCRZC suppressed the replication of HCV by 54. 7% and 62.1%, respectively. Furthermore, when the two ribozymes were cotransfect ed into cells, they suppressed replication by 78.8%.ConclusionTwo specific antisense ribozymes have strong in

6、hibit ory effects on the replication of HCV in cultured cells, and have better effect when used together.【Key words】Ribozyme； Hepatitis virus, type C; MT-2 cells核酶(Ribozyme)是一类具有特异性剪切RNA活性的RNA分子。1990年Sarver等1 首先报道在体外培养的细胞中用核酶成功抑制了人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制，引起越 来越多的医学和生物 工作者的重视。目前核酶已开始应用于人体内治疗2。然而，核酶步入临床实践 前，还

7、有许多问题有待于解决。例如：如何选择靶序列中最佳切割位点，如何获得高效、无 毒的特异性反式核酶，如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等。我们在已建立的 丙型肝炎病毒(HCV)感染的细胞模型中进行HCV特异性锤头状核酶抑制HCV复制的研究，探 讨核酶抗HCV的效果 和作用机制。材料和方法一、材料(一) HCV感染MT-2细胞模型MT-2细胞为人CD4+T细胞株，按照Kato等3报道 的方法制备。(二) HCV 5非编码区(NC)及核心区(C)核酶基因及相应的反义引物根据Sakamoto等 4报道的序列，在德国Luebeck医科大学微生物研究所合成。(三) 其他主要试剂TA克隆试剂为美国In

8、vitrogen公司产品，以多聚酶链反应产物克隆载 体2.1(PCR 2.1)为载体，在插入片 段两侧各有一个Eco RI位点。真核表达载体pSV2-gpt.CD-SR由日本九洲大学免疫学研究 所王继扬博士赠送，该质粒带有SV40启动子、信号肽及poly A序列，并带有大肠杆菌的gpt 基 因，该基因编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)可将黄嘌呤转化为鸟苷酸(GMP)的前 体黄苷酸(XMP)，因此可恢复共转染后的受体细胞在XHTA-M选择性培养基(含20%胎 牛血清 、250 g/ml黄嘌呤、15 g/ml次黄嘌呤、10 g/ml胸腺嘧啶、2 g/ml氨基喋呤和25 g/ml霉酚酸的

9、1×RPMI 1640培养基，pH 7.4)中被霉酚酸和氨基喋呤阻断的哺乳细胞 的GMP 生物合成途径。外源片段插入该载体的Eco RI位点后转染真核细胞，经gpt筛选可获得稳定 表达的重组体。地高辛(Dig)DNA 3末端标记试剂盒以及核酸检测试剂盒为德国Boehring M annheim公司产品。二、方法(一) 抗HCV核酶与pSV2-gpt.CD-SR的重组在Taq DNA聚合酶作用下，分别将HCV NC及C 区 核酶基因补成双链，按试剂盒说明书进行TA克隆，转化TOP 10F菌株，经用含有氨苄青霉素 和 X-gel/IPTG的选择性平板作抗性和蓝、白斑筛选，挑出重组克隆后，

10、扩增并纯化重组体， 用内切酶Eco RI进行酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，回收和纯化目的片段，按分子克隆常 规插入pSV2-gpt.CD-SR载体中。为了鉴别抑制HCV复制的作用是来自核酶的切割还是反 义核酸的封闭，以同样的方法构建与HCV C区核酶基因相同但在核酶活性区中有一点突变的 对照重组体，方法与上述相同。上述重组体用相应的探针作斑点杂交后选出阳性克隆，HCV NC区、C区核酶基因及点突变的C区核酶基因分别命名为HCRZNC、HCRZC和HCRZCM。(二) HCV感染MT-2细胞用HCV阳性血清感染MT-2细胞后，动态收获部分细胞，用Trizo l试剂提取总RNA，进行逆转录-聚合酶

11、链反应(RT-PCR)检测HCV RNA及其复制中间体，并以 Southern杂交证实，确定HCV感染成功及其感染的时间。(三) HCV核酶重组体转染HCV感染的MT-2细胞HCV感染后的MT-2细胞培养至第5天，用磷 酸钙转染法将上述HCRZNC、HCRZC和HCRZCM重组体转染细胞，操作方法参见文献5。转 染细胞培养60 h后收获并洗涤，加XHTA-M选择性培养基重悬细胞，继续培养。(四) 细胞RNA的提取和检测于转染后第3、6、9天各收获3×105细胞，用Trizol试剂 抽提总RNA，并以DNase I酶消化后进行如下检测：1.HCV RNA定性检测按先前报道的方法进 行6

12、。2.Southern杂交按试剂盒说明书，以HCV NC、C区核酶基因、点突变的C区 核 酶基因寡核苷酸片段及HCV C区寡核苷酸引物分别用Dig进行DNA 3末端标记。PCR产物电泳 后 ，进行Southern杂交和显色。3.HCV RNA定量RT-PCR检测采用HCV RNA定量检测试剂盒(Ro che Amplicor HCV Monitor TM Test，瑞士Roche公司产品)，对第9天收获的细胞进行定量 检测。操作按说明书，并设对照。(五) 细胞毒性试验与未转染核酶基因的细胞对照，动态观察转染核酶基因的各组细胞在 形态和生长方面的情况。结果一、HCV感染MT-2细胞用HCV阳性血

13、清感染的MT-2细胞在培养第7天开始RT-PCR检出HCV RNA，可持续阳性至第28 天 。HCV复制中间体于感染后第10天出现，第18天消失。上述结果经Southern杂交证实其阳性 条带为HCV特异性序列。二、斑点杂交鉴定核酶分别用特异性探针作斑点杂交，选出阳性克隆。1示斑点杂交鉴定核酶与pSV2-gpt.CD-S R的重组结果。     构建好的HCRZC、HCRZCN和HCRZCM各取10个克 隆点膜，以含5NC区和C区基因的HCV cDNA片段为探针杂交，中A为PCR2.1空载体对照；B 为pSV2-gpt.CD-SR空载体作阴性对照；C为H

14、CRZC重组体；D为HCRZNC；E为HCRZCM重组体 1斑点杂交鉴定核酶重组体结果三、RT-PCR和Southern杂交HCRZNC和HCRZC处理的感染细胞中HCV RNA的阳性信号均低于HCRZCM转染的细胞和无核酶基因 插入的空pSV2-gpt.CD-SR载体转染的细胞。定量PCR结果见2，经计算，HCR MNC、 HCRMC的抑制作用分别为54.7%和62.1%，两者联合应用时达78.8%。定性PCR结果未 见HCRZCM 对HCV 感染的MT-2细胞中HCV RNA阳性信号有明显影响，定量PCR结果则表明该重组体转染细胞后 ，对HCV复制具有一定的抑制作用，抑制率为28.3%。&

15、#160;    CM为点突变的C区核酶(HCRZCM)；NC为HCV 5NC区核酶(HCRZNC)；C为HCV C区核酶(HVR ZC)； NC+C为此二种核酶联合应用；阳性为无核酶基因插入的载体对照；阴性对照为无HCV感染的M T-2细胞对照2核酶对HCV的抑制率四、细胞形态学观察与对照组细胞比较，未发现转染有核酶基因的各组细胞在形态和生长方面出现异常。讨论HCV感染易导致慢性化，可发展成为肝硬化甚至肝癌。目前主要用干扰素进行治疗，但疗效 尚不够满意7，8。因此，有必要寻找其它抗HCV治疗途径。近年来，应用反义核 酸和核酶进行抗病毒治疗的研究有了较大的进展。由

16、于体外合成RNA价格极为昂贵，且在细 胞内容易被RNA酶降解而失活，故从策略上说，核酶抗病毒治疗以基因表达途径，即将核酶 基因用合适的载体导入细胞内，在细胞内转录产生核酶从而发挥抗病毒作用更为有效。由于 细胞内表达的核酶受到天然的修饰，不易为核酸酶降解，提高了核酶在细胞内的稳定性。我 们 将体外合成的HCV NC区和C区基因的两个反式核酶基因分别克隆入真核细胞表达载体pSV2-g pt.CD-SR中，转染已证明被HCV感染的MT-2细胞模型，在相对比较接近自然感染的状态下，探讨核酶的抗HCV作用。重组HCV 5NC区及C区核酶基因(HCRZNC和HCRZC)作用于HCV感染的MT-2细胞后，定

17、量RT-P CR表明单独使用HCRZNC或HCRZC对HCV的抑制率分别为54.7%和62.1%。两者联合作用 时抑制率 达78.8%，提示HCV 5NC区和C区特异性反式核酶在HCV感染的MT-2细胞模型中对HCV复制均 有明显的抑制作用，两者联合使用较单独使用效果更好，且对细胞无明显的不利影响。核酶 活性区中有一点突变的对照重组体(HCRZCM)对HCV复制具有一定的抑制作用，推测该抑制作 用与核酶两侧的HCV特异性结合部位有关，在以往我们利用特异性反义寡核苷酸体外抑制HCV 的研究中证明了这一点9。作者单位：陈智（310003杭州，浙江大学医学院附属一院传染病研究所，卫生部病毒性传染病重

18、 点实验室）刘勇（310003杭州，浙江大学医学院附属一院传染病研究所，卫生部病毒性传染病重 点实验室）刘克洲（310003杭州，浙江大学医学院附属一院传染病研究所，卫生部病毒性传染病重 点实验室）Dennin RH（德国Luebeck医科大学微生物研究所）Reinh ard U（德国Luebeck医科大学微生物研究所）窦俊（南京铁道医学院）参考文献1，Sarver N, Cantin EM, Chang PS, et al. Ribozymes as potential anti-HI V-1 therapeutic agents. Science, 1990,247:1222-1225.2

19、，Ohkawa J, Koguma T, Kohda T, et al. Ribozymes: from mechanistic studies to ap plications in vivo. J Biochem Tokyo, 1995,118:251-258.3，Kato N, Nakazawa T, Mizutani T, et al. Susceptibility of human T-lymphotropi c virus type I infected cell line MT-2 to hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun, 1995,206:863-869.4，Sakamoto N, Wu CH, Wu GY. Intracellular cleavage of hepatitis C virus RNA and inhibition of viral protein translation by hammerhead ribozymes. J Clin Invest 1996,98: