生黑醋酸杆菌山梨醇高浓度发酵的培养特性

1、生黑醋酸杆菌山梨醇高浓度发酵的培养特性荆士华1,2,汲涌2,陈宏权2,姜铭妍2,谌明2,杨伟超1,张海宏2,徐慧13(1.中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳110016;2.东北制药总厂,辽宁沈阳110026摘要调节生黑醋酸杆菌的代谢特性,实现其在高浓度山梨醇下的发酵。改变发酵所用种液的培养特性以及在发酵中期补加山梨醇。在摇瓶培养条件下,通过上述方法可以将Vc一步发酵中底物山梨醇的浓度从23%提高到38%,培养30h时发酵率达95%,山梨糖产量达360mg/mL。在优化后的实验条件下山梨糖的发酵产率得到明显提高。关键词发酵;山梨醇;山梨糖;高浓度;种液中图分类号Q93文献标识码B文章编号1

2、005-7021(200904-0103-04The fe rm en ta ti on character istic of G luconbacter m elanogenus i n m ed ium w ith h i gh concen tra ti on of D2sord ibo l J ING Shi2hua1,2,J I Yong2,CHE N Hong2quan2,J IANG M ing2yan2,CHE N M ing2,Y ANG W ei2chao1,ZHANG Hai2hong2,XU Hui1(1.Institute of A pplied Ecology,Ch

3、inese A cade m y of Sciences Shenyang,110016;2.N ortheast General Phar m aceutical Factory L iaoning Shenyang,110026AbstractTo contr ol the characteristic of Gluconbacter m elanogenus in mediu m with high concentrati on of D2s ordibol (38%.Experi m ents were i m p lemented by adding D2s orbit ol dur

4、ing fer mentati on and changing innoculiu m.The re2 sults showed that the strain could be cultured well in mediu m containing D2s orbit ol fr om23%t o38%.The conversi on rate of D2s orbit ol t o L2s orbose in mediu m with38%D2s orbit ol was95%after fer mentati on for30hour.Pr oductivity of s orbose

5、was i m p r oved notably under op ti m ized conditi ons.KeywordsFer mentati on;S orbit ol;Sorbose;I nnoculiu m维生素C(V ita m in C,Vc在医药和临床方面都具有重要的应用价值,亦广泛用于食品工业和化妆品工业3,4。目前工业上主要用莱氏法1和两步发酵法2生产Vc,此两种方法初始均经发酵将D2山梨醇转化为L2山梨糖5,6。发酵中山梨醇投料浓度为23%左右,近期,德国巴斯夫等公司将山梨醇投料浓度提高达50%以上。为提高生产率,实现山梨醇高浓度发酵,根据生黑醋酸杆菌的生长特性,采用

6、发酵中途补醇及改变发酵种液的方法,研究了生黑醋酸杆菌在高底物浓度中的培养特性及山梨醇转化效率。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株生黑醋酸杆菌Gluconbacter m elano2 genus(简称黑醋菌,由东北制药总厂Vc公司提供。1.1.2试剂D2山梨醇:东北制药总厂自制;葡萄糖:沈阳化学试剂厂生产,分析纯;酵母膏:广东环凯微生物科技有限公司;玉米浆、碳酸钙由东北制药总厂Vc公司生产车间提供;硫酸铜:沈阳新兴试剂,分析纯;丙三醇:沈阳新兴试剂厂,分析纯;琼脂:青岛海燕牌。作者简介:荆士华女,硕士研究生,高级工程师。研究方向为生物发酵。E2mail:jingshhs 3通讯作者。Tel:

7、024*,E2mail:xuhui收稿日期:2008209217;修回日期:2009204221301微生物学杂志2009年7月第29卷第4期JOURNAL OF M I CROB I O LOGY July2009Vol.29No.41.1.3培养基(质量分数,%分离培养基:葡萄糖10,酵母膏0.7,碳酸钙1,琼脂2.5;发酵培养基:D2山梨醇2335,玉米浆0.2,酵母膏0.04,碳酸钙0.07。1.1.4仪器721分光光度计,上海第三分析仪器厂;PHS22F pH计,上海精密科学仪器有限公司。1.2方法1.2.1黑醋菌生长曲线的测定A600值光密度测定法7。1.2.2种液制备选择不同培养

8、阶段(12、14、16h的35%山梨醇浓度发酵液,作种液。1.2.3摇瓶发酵培养各种液以20%的接种量接入发酵培养基(180mL发酵培养基/750mL三角瓶,32,250r/m in培养,不同时间取样,测山梨糖浓度、pH值。1.2.4补醇培养初始发酵投山梨醇量为23%,发酵10h后补加山梨醇至所设计浓度。1.2.5分析方法甘油酮测糖法8。2结果与分析2.1黑醋菌在不同山梨醇浓度下的生长特性采用分光光度法检测黑醋菌在不同山梨醇浓度下的生长曲线,结果见图1。由图1可知,23%山梨醇投料时,菌体在培养810h时为对数生长期,在培养10h后进入稳定期。35%投山梨醇时,菌体在培养1012h时为对数生长

9、期。2.2发酵过程中补醇对黑醋菌产糖的影响不同山梨醇浓度发酵,山梨醇一次性投入和分批投入,效果不一。实验结果如下。由表1及表2可以看出,30%山梨醇浓度下发酵,发酵中期补加山梨醇组较一次投醇效果好,但优势不明显;35%山梨醇浓度发酵,发酵中期补加山梨醇组较一次投醇效果好,山梨糖产量提高达8%。2.335%山梨醇浓度发酵终点醪液做种液接种时对发酵的影响采用35%山梨醇浓度发酵终点醪液做种液,测定了对黑醋菌发酵的影响。由表3可知,以35%山梨醇浓度发酵终点醪液做种液效果最好,最高30h产山梨糖360mg/mL,而同样条件下的生产种液32h产山梨糖仅为270mg/mL 。图1不同山梨醇浓度下黑醋菌的

10、生长曲线Fig.1Gluconbacter m elanogenus gr owth curvein different s orbit ol concentrati on表130%山梨醇浓度发酵结果Table1Fer mentati on results of30%s orbit ol一次投30%山梨醇发酵10h补山梨醇至30%组别pH山梨糖量/(mgmL-1pH山梨糖量/(mgmL-1 20h 4.58153(3.54 4.54170(7.0724h 4.46203(10.61 4.44203(10.6128h 4.42240(7.07 4.40232(17.6730h 4.40255(7

11、.07 4.38262(10.61注:表中数据为3组数据的平均值,括号内为标准偏差,下表同401微生物学杂志29卷表235%山梨醇浓度发酵结果Table 2Fer mentati on result of 35%s orbit ol一次投35%山梨醇发酵10h 补山梨醇至35%组别pH山梨糖量/(mg mL -1pH 山梨糖量/(mg mL -120h 4.50168(3.53 4.46175(024h 4.43195(7.07 4.38204(4.9528h 4.36232(3.53 4.35240(030h4.39240(04.36260(0表335%山梨醇浓度发酵终点醪液做种液对产糖的影

12、响Table 3The effect of fer mentati on br oth with 35%s orbit ol inoculating fer mentati on on s orbose p r oduct种液特性17%山梨醇浓度生产种液17%山梨醇浓度生产种液35%山梨醇浓度发酵醪液发酵培养基山梨醇量22.54%32.94%37.97%组别pH 山梨糖量发酵率/%pH 山梨糖量发酵率/%pH 山梨糖量发酵率/%/(mg mL -1/(mg mL -1/(mg mL -122h 4.57188(3.5383 4.63153(3.5346 4.58208(10.615524h 4

13、.58205(091 4.59183(3.5357 4.53240(14.16328h - 4.35250(14.176 4.43350(17.79230h - 4.43360(14.19532h-4.46270(7.0782-2.435%山梨醇浓度下不同发酵时期的醪液做种液接种时对发酵的影响选择不同培养阶段的35%山梨醇投料浓度发酵液作种液接种对山梨糖产量的影响。结果见图2。图2不同种液接种时的发酵结果Fig .2The fer mentati on results in different innoculium inoculating由图2可知,作为种液,35%山梨醇投料中期发酵液作种液接

14、种发酵,效果与发酵终点醪液没有明显差别,均明显优于生产种液。3讨论研究发现,改变发酵种液特性可明显提高山梨醇投料浓度至38%,摇瓶发酵30h 发酵率可达95%,山梨糖产量达360mg/mL 。而中途补醇,可解除底物浓度过高时对转化酶的抑制作用;实验得知,菌体生长10h 达峰值,此时补醇可以减小高山梨醇底物浓度对菌体生长的影响。有文献报道9,发酵中途流加山梨醇可提高山梨糖产率,但过程控制较复杂,不如一次补加易于操作。以35%山梨醇浓度的发酵醪液做为种液时,种液培养和发酵培养的外部环境一致,菌种对高山梨醇浓度已经具备了一定的适应力,因此,起转化作用的酶可以迅速进入良好的作用状态。根据黑醋菌生长特性

15、,选择不同培养阶段的5014期荆士华等:生黑醋酸杆菌山梨醇高浓度发酵的培养特性35%山梨醇浓度发酵液, 比较接种后对产糖及发酵率的影响。结果表明,不同培养阶段的发酵液间差别不大,实践中,可选择短期培养物作种液,以缩短种液制备时间,减少发酵整体周期。黑醋菌发酵时对接种量的要求很高,只有菌体达一定量时才能满足生产的需要。根据黑醋菌的生长特性,发酵培养中期时菌体量已经达到最大值,可以满足发酵的要求,实验结果也证明了这一点:各时期的发酵液和发酵终点醪液作为种液时,各组间山梨糖产量没有明显的差别。参考文献:1Recichsein,T,Grussner,A and Oppenauer .Synthesis

16、 of d 2andl 2Fascorbic acidJ .Nature,1933,1322280.2宁文珠,尹光琳,陶增鑫,等.维生素C 生产二步发酵法P .欧洲专利:278447,1988.3Combs GF .The V ita m ins,Funda mental A s pects in Nutriti onand HealthM .Acade m ic Press,2001,2452272.4H ickey Steve and Roberts H ilary .A scorbate:The Science ofV ita m inC M .Lulu Press,2004,20225

17、05E .Shinaga wa,K .Matsushita,O.Adachi,et al .Pr oducti on of 52ket o 2D 2gluconate by acetic acid bacteria is catalyzed by pyrr ol o 2quinoline quinone (P QQ 2dependent me mbrane 2bound 2D 2glu 2conate dehydr ogenase J .Agric .B i ol .Che m.,1982,(46:1352141.6E .2S .Choi,E .2H.Lee,S .2K .Rhee .Gluc

18、onobacter suboxydanss orbit ol dehydr ogenase,genes and methods of use thereofJ .FE MS M icr obi ol .Lett .,1995,(125:45250.7张舟,冯树,江晶,等.Vc 二步发酵拌生菌巨大芽胞杆菌的选育J .微生物学杂志,1999,19(2:8210.8耿海义.维生素C 发酵工艺的研究D .天津大学硕士毕业论文,2003,34235.9R.Giridhar,A shok K .Srivastava .Computer coup led substratefeeding strategies for efficient conve