仪器分析讲义第三章

1、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 （1）高压高压：150-350105 Pa：液相色谱法以液体为流动相：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。 （2）高速高速：通常小于：通常小于1h。（可达。（可达1-10mL/min30mL/h。）。）（3）高效高效：大于：大于30000塔板塔板/米米普通填充柱效普通填充柱效1000塔板塔板/m.近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 （4）

2、高灵敏高灵敏：10-9g （紫外检测）、（紫外检测）、10-11g （荧光检测）（荧光检测） 理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理effeffnLH/ 2212)(54. 5)(16WtWtnRReff0ttkR2)1(kknneff理（填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/pdA2pdAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL为什么？）（忽略纵向扩散项：,uCAHHPLCRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，dpA2dpA柱效，nHAdp?0uDCHmdd

3、ssmmCCCCuCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，但易产生气泡mmDTCDTpedH2uDdCHsfss2uDdCHmpsmsm2uDdCHmpmm222114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：1 液 液分配色谱法流动相和固定相都是液体。流动相与固定相

4、之间应互不相溶，有一个明显的分界面。溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：smmsVVkCCK液-液分配色谱与气-液分配色谱异同：同：分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大。异：液相色谱中流动相的种类对分配系数的影响很大，气相色谱中流动相性质对分配系数影响不大。液液色谱法中，为避免固定液流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性，这种情况称为正相液-液色谱法。若流动相极性大于固定相极性，则称为反相液液色谱法。其出峰顺序与正相液液色谱法相反。色谱分离过程中，由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液不断流失而

5、导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果，为更好的解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同的有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相。！反相化学键合相色谱法，在高效液相色谱法中应用广泛。2 液 固色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是溶质分子 (X) 和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附。若溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应地减少。吸附剂对分配系数大的组分吸附力强，相应的保留值也大。 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和

6、异构体有较高的选择性。缺点：非线性等温吸附会引起峰拖尾现象。3 离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法是将一种离子对色谱法是将一种 ( 或多种或多种 ) 与溶质分子电与溶质分子电荷相反的离子荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子称为对离子或反离子 ) 加到流动相或加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。合物，从而控制溶质离子的保留行为。流动相中待分离的有机离子流动相中待分离的有机离子X+（或带负电荷的离子）（或带负电荷的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子与固定相或流动相中带相反电荷的对离子Y-

7、结合，形结合，形成离子对化合物成离子对化合物X+ Y- ，然后在两相间进行分配。，然后在两相间进行分配。 YX Y -K-XY有机相水相水相X平衡常数 KXY水相水相有机相YX-YXKXY溶质分配系数 DX水相水相有机相YKX-XYYXDX离子对色谱法离子对色谱法（流动相和固定相）正相离子对反相离子对反相离子对极性流动相（含Y-）（甲醇-水，乙腈-水等）试样离子X+疏水性离子对X+Y-X+Y-在固定相表面分配吸附。容量因子k1水相YKVVDkXYMSX滞留因子：Rs=1/(1+k)=us/u, tR=L/us）水相11 (YKuLtXYR可用于生化试样（核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱及药物等分离

8、。可在离子对生成时，引入紫外吸收或荧光基团，从而提高检测灵敏度。4. 离子交换色谱法离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。5. 离子色谱法用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。洗脱反应则为交换反应的逆过程.6 空间排阻色谱法空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分

9、子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子， 首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。 可用于在流动相中可溶的，分子质量差别在10%以上的分子。液 - 液色谱法、键合色谱法及离子对色谱法固定相所用的担体可分为如下几类： 全多孔型担体是颗粒均匀的多孔球

10、体。 100m表层多孔型担体 又称薄壳型微珠担体。从开始的直径为 30 40 m 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，表层上附有一层厚度约为 1 2m 多孔表面 ( 多孔硅胶 ) 。 目前多为5-10 m的全多孔微粒担体，缺点：固定液机械涂附在担体上，固定液流失不可避免。为克服此缺点，出现新型固定相化学键合固定相化学键合固定相 (3) 化学键合固定相 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面 ( 具有 Si OH 基团 ) 的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型 ( Si O C ) ；硅氧硅碳键型 ( SiOSiC ) 硅碳键型（ SiC ）和硅氮键型（ SiN

11、）四种类型。 化学键合固定相具有如下一些特点： . 表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多； . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。 化学键合相色谱应用2 液固吸附色谱法固定相采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。分为全多孔型和薄壳型。目前多为5-10m全多孔型硅胶微粒3 离子交换色谱法固定相（ 1 ）薄膜型离子交换树脂即以薄壳玻珠为担体，在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 （ 2 ）离子交换键合固定相用化学反应将离子交换基团键合在惰

12、性担体表面。4 排阻色谱法固定相（ 1 ）软质凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相。 （ 2 ）半硬质凝胶如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶）是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。 （ 3 ）硬质凝胶如多孔硅胶、多孔玻珠等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。 高效液相色谱仪典型结构示意图（） 往复式柱塞泵 当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变

13、化的影响，连续供给恒定体积的流动相。（2）气动放大泵 其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞 A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 105Pa的气体就可得到压力为 250 105Pa的输出液体。这是一种恒压泵。2 梯度洗提梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素(容量因子和选择性因子），以提高分离效果。梯度洗提可以

14、分为低压梯度（也叫外梯度）：在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，混合后送入色谱柱。 液相色谱仪操作视频资料液相色谱仪操作视频资料如何应用高效液相色谱对试样分离、分析：因综合考虑各种因素：试样的性质（相对分子质量、化学结构、极性、溶解度等化学和物理性质）。液相色谱分离类型的特点及应用范围。实验室条件（仪器、色谱柱等）1.液相色谱分离类型选择参考表简单分析教材中提到的实例，解释原因。1.色谱柱柱容量（柱负载）：分析型色谱柱柱容量：指在不影响柱效能情况下最大进样量。通常进样量小于1mg/g吸附剂，保留

15、值k和柱效H不随进样量改变而变化。超过此进样量，色谱柱超载，柱效大幅度降低，峰形变宽，分离度变差，保留值也发生变化。进样量越大柱效越低，分离度越差，是制备色谱主要限制之一。制备色谱柱柱容量：指在不影响收集物纯度前提下最大进样量。制备柱允许过载，但柱效降低不宜过半或容量因子中减少超过10%。2. 液相制备色谱方法A、欲分离组分呈现一个单峰n在分析型HPLC上进行试验，n利用色谱分离基本方程，通过k、，n值的优化提高分离度。n增加进样量直到色谱峰发生重叠，在柱负荷极限内，扩大柱径，以提高允许最大试样量，并扩大输液泵流量，分离出纯组分。n若要获得更大量的纯物质，可使柱超载运行，此时产生峰重叠，按中心切割法收集少量馏分，以分析型HPLC或薄层