神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展

1、神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展 硕士研究生 孙晓静 导师 孙莉 传统的观点认为，"中枢神经细胞不可再生"，然而自1992年 Reynolds等从成年鼠脑纹状体和海马中首次分离出了神经干细胞（NSC） ,且它与多能干细胞一样具有自我更新、分裂增殖、多向分化的潜能，此后人们开始深入了解神经干细胞。Erikson等于1998年也证实了人脑中同样存在神经干细胞，随后的研究发现成年脑中神经干细胞主要存在于侧脑室外侧壁脑室下区和海马齿状回中。随着近年来对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或移植治疗的研究深入，为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或神经退行性疾病等的

2、治疗提供了新的方向。 阿尔茨海默病（AD）是老年人常见的一种慢性进行性神经系统变性疾病。长期以来认为前脑胆碱能投射系统（尤其是Meynert基底核）胆碱能神经元变性、细胞数量减少等导致AD认知功能不可逆的减退。目前就其病因有多种学说：如基因学说（APP基因 1 、早老蛋白基因 2 、ApoE基因 3 ）、胆碱能假说、雌激素水平下降学说4 、氧化应激学说 5 、铝中毒学说、炎症学说6 、神经营养因子学说7 等。此外，AD还可能与年龄、种族、社会心理因素及各种疾病史等多种因素有关。 综上所述, 多因素参与 AD 发病, 但目前为止确切的发病机制尚不清楚。其治疗方法包括对于轻度和中度 AD 予以乙酰

3、胆碱酯酶(AChE抑制剂以提高认知功能, 以及 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA拮抗剂对重度 AD 的治疗8,其他药物如脑循环改善药物剂、 AChE 抑制剂、 M1 胆碱受体激动剂、乙酰胆碱释放促进剂、 神经生长因子、 抗氧化药物和抗 -淀粉样药物等。这些治疗手段虽能减轻 AD 的症状, 但无法补充大脑皮层和海马大量丢失的神经细胞,因而对中、 晚期AD 患者的疗效有限。神经干细胞(NSCs的广泛研究及重大进展为 AD 的治疗提供了一个更有前景的治疗策略，NSC移植治疗AD等退行性疾病成为近年来的研究热点。然而不管是诱导、促进内源性NSCs增殖分化，产生相应的神经细胞代替缺损变性的细胞，还是体外

4、培养需要的NSCs移植入体内，如何诱导NSCs定向分化为胆碱能神经元都是一个至关重要的问题。 神经干细胞增殖、分化相关因素 神经干细胞的增殖、迁移、分化与多种因素相关。目前的研究认为决定神经干细胞定向分化的机制有两种：一种是细胞自身基因调控；另一种是外来因素调控，主要为各类细胞因子家族，如神经营养因子、生长因子、细胞黏附因子等均可影响神经细胞的分化，其影响机制各不相同。不同的细胞因 子诱导分化出的神经元不同。研究最多有生长因子如：表皮生长因子（EGF）家族、碱性成纤维细胞生长因子（FGF）家族、-转导生长因子（-TGF）超家族、神经营养因子、脑源性生长因子及化学诱导剂及药物等。 一、生长因子

5、碱性成纤维生长因子(FGF在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用, 使神经干组胞获得对另一作用更强的促有丝分裂因子表皮生长因子（EGF）的反应性;而表皮生长因子在神经干细胞增殖后期发挥作用 9。两种因子对神经干细胞分化方向的作用也不相同, 碱性成纤维生长因子能增加干细胞向神经元分化的比例, 而表皮生长因子敏感的干细胞生成的神经元常常少于 1%, 绝大多数是星形胶质细胞, 且这两种生长因子作用的神经干细胞分化形成的神经元多为 - 氨基丁酸能神经元10。Tarasenko 等9比较碱性成纤维生长因子、 表皮生长因子和外源性白血病抑制因子联合及单独应用对培养的人胚神经干细胞的影响, 发现上述

6、 3 种生长因子联合应用对人胚神经干细胞的扩增最有效, 人胚神经干细胞在有碱性成纤维生长因子, 肝素及层粘连蛋白的联合作用下往胆碱能神经元方向分化。 二、 转化生长因子超家族 骨形成蛋白是转化生长因子超家族中最大成员。在原肠胚期, 骨形成蛋白首先表现为抑制神经外胚层的形成; 在神经管期,不同浓度的骨形成蛋白和其他细胞因子共同促进神经管背部不同类型神经细胞的分化; 在发育晚期, 作用于腹侧区的神经前体细胞, 抑制这些细胞分化为神经元及少突胶质细胞, 促进其分化为星形胶质细胞,同时也作用于非腹侧区的神经前体细胞, 促进其存活及分化11。骨形成蛋白 2 可以明显抑制 Oligr2(促进神经前体细胞向

7、神经元和少突胶质细胞分化的一种重要转录调控因子的表达, 从而抑制少突胶质细胞分化12。Varley 等试验研究证明骨形成蛋白 2 是神经嵴细胞向肾上腺素能神经元分化的有效调节物13。在中枢神经系统发育中, 骨形成蛋白 2 在室管膜区表面有表达, 可以启动VZ 内的新皮层前体神经细胞向神经元分化。体外培养的神经上皮细胞在骨形成蛋白 2 作用 24 h 之后, 可以增加分化产物中神经元数目, 提示骨形成蛋白 2 能够促进神经干细胞向神经元分化。 三、 神经营养因子、脑源性生长因子 神经营养因子刺激鸟类神经管前体细胞分化为运动神经元, 但对分化的离体运动神经元的存活总数则无明显影响。但是神经营养因子

8、对细胞分化的影响似乎是通过促进已分化的神经细胞的成熟, 而不是使未分化的多能干细胞向神经元分化。脑源性生长因子、 胰岛素样生长因子、 血小板源性生长因子等被证实增加神经干细胞向神经元表型方向的分化。睫状神经营养因子和白血病抑制因子作用于 多潜能神经干细胞, 诱导它们分化成星形胶质细胞;而甲状腺素 T3 则促使其分化为少突胶质细胞 14。Kim 等15研究表明, 粒- 巨噬细胞集落刺激因子可促进神经祖细胞增殖, 抑制其分化及凋亡。另外, 参与神经干细胞诱导分化的细胞因子有细胞因子白细胞介素类, 如白介素 1具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用, 联合应用白介素 1、白介素11、白血病抑制

9、因子和胶质细胞源性神经营养因子对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作用16。 四、化学诱导剂及药物 化学诱导剂被引进神经干细胞体外诱导实验中并被证实有效, 邓红等17分离培养新生大鼠纹状体脊髓神经干细胞, 观察不同浓度全反式视黄酸对脊髓神经干细胞的影响, 结果发现全反式视黄酸诱导脊髓神经干细胞向神经元方向分化, 其作用在一定范围内呈剂量依赖性, 脊髓神经干细胞的RAR基因的表达对全反式视黄酸存在剂量依赖性和时间依赖性。王飞等18用不同浓度(0.5 mol/L、1mol/L、5 mol/L和 10 mol/L的全反式维甲酸在体外诱导人胚胎神经干细胞, 全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干

10、细胞分化为神经元的比例, 其中1 mol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例最高。 目前已知，细胞因子、生长因子以及内环境等因素的作用可诱导神经干细胞向不同的终末神经细胞分化，诸如成纤维细胞生长因子诱导神经干细胞的主要分化方向是-氨基丁酸能神经元；鼠胶质细胞源性生长因子于中枢神经系统可诱导出多巴胺神经元，于周围神经系统可产生施万细胞；白细胞抑制因子与多巴胺能神经元生成相关19 。胶质源性神经营养因子GDNF在NSC分化为多巴胺神经元中起重要作用 20 .神经营养因子家族中BDNF能增加EGF诱导增殖的神经前体细胞向GABA（-氨基丁酸）能神经元分化，并且也能刺进神经前体细胞向胆碱

11、能神经元分化。 中枢胆碱能神经系统是中枢胆碱能神经元及其纤维投射分布的部位，乙酰胆碱（Ach）作为中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与学习和记忆等相关的生理活动。大脑退行性变的疾病常引起中枢胆碱能神经系统受损并导致学习和记忆等高级神经功能障碍，这是AD等疾病重要的发病机制。 胆碱能神经相关的细胞因子 一、 神经营养因子（NGF） NGF由中枢胆碱能神经系统合成、分泌，反过来支持和营养中枢神经系统，因此对神经营养因子对胆碱能神经的保护和维持作用的研究很多。NGF在脑内的主要 作用部位是基底前脑胆碱能神经系统,能促进胆碱能神经元发育,增强突触的可塑性和神经元的功能,使胆碱能神经细胞中的Ach、

12、ChAT 和AchE等活性增强,并促进其存活和纤维的延伸21 ,22。研究表明,若注射 NGF抗阻断NGF与其受体的结合,基底前脑胆碱能神经元的 ChAT 和 AchE活性会明显下降22。此外Calza 等23在损毁基底前脑胆碱能神经元后, 于侧脑室注射 EGF 和 bFGF 14 d后, 再改用 NGF 注射 14 d, 结果除发现基底前脑胆碱能神经元受损大鼠的学习记忆功能得到明显改善外, 形态学也证实脑内海马等处有较多的神经干细胞被 NGF 诱导分化为胆碱能神经元。也有实验结果24发现 NGF 可诱导皮层和隔区来源的神经干细胞向成熟的 AChE 阳性的胆碱能神经元分化。且隔区来源的神经干细

13、胞比皮层来源的神经干细胞更易于向AChE 阳性神经元分化, 这可能是因为隔区来源的神经干细胞具有更易于向胆碱能神经元分化的区域特异性。 BDNF作为一种重要的神经营养因子亦有众多的研究报导，神经干细胞的增殖首先需要有丝分裂原的作用,表面生长因子 ( EGF和碱性成纤维细胞生长因子 ( bFGF是神经干细胞体外增殖的重要的有丝分裂原 ,并且多数研究认为 bFGF与 EGF分别在胚胎发育早晚期促进神经前体细胞的增殖 ,并可促神经干细胞向神经前体细胞、 胶质前体细胞分裂 25 ,而 BDNF在定向祖细胞分化成终末细胞中起重要作用 26 。BDNF在体外可促进 NSC的存活和促进其向神经元分化。诸如林

14、玲等人 27通过体外培养出生 23d大鼠脑皮质的神经干细胞 ,应用免疫荧光术分别观察 BDNF组和对照组中2tubulin阳性神经元数 ,结果发现 BDNF组阳性细胞数明显多于对照组 ,且神经元的突起明显较对照组长。谢青松等人 28 利用孕 14d大鼠胚胎脑组织中的神经干细胞在体外加入BDNF诱导分化 1、3、和 5d后行流式细胞仪检测发现: BDNF组神经元的比例较对照组各时段的比例提高了 1倍。中枢神经系统的功能主要依赖于神经元 ,不同类型的神经元其功能也不同 ,而神经元的种类是按神经递质来区分的。研究已证实 BDNF能增加 EGF诱导增殖的神经前体细胞向 GABA(-氨基丁酸 能神经元分

15、化 ,并且也能促进神经前体细胞向胆碱能神经元分化。这为外源性神经干细胞移植治疗中枢性疾病提供了依据。 二、 骨形态发生蛋白（BMP） BMPs是转化生长因子超家族最大的成员，也是影响神经发育的重要基因组之一，BMPs从神经发生到神经系统发育成熟的不同时期、不同脑区均起着相当重要的作用。2000 年 , Lgnacio等 29 报道,在培养的神经细胞中, 骨形态发生蛋白9 (BMP9直接诱导编码乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱转动囊基因的表 达及上调乙酰胆碱的合成 , 脑室内注射 BMP9 可增加活体的乙酰胆碱水平, 说明BMP9 是胆碱能中枢神经系统的分化因子。BMP家族中的 BMP4 也具有相应的效

16、应。BMPs在不仅神经系统的发育中有多种作用 , 且对神经营养因子的作用产生影响 30 。不同浓度的BMPs对不同时期 NSCs 的分化具有不同作用。如在 E16大鼠的皮层 , 1 - 10ng/ mL BMPs可以促进神经元和星形胶质细胞的分化 , 100ng/ mL则使细胞死亡 31 。常艳 32 等人所做实验用表皮生长因子( EGF和成纤维生长因子(FGF将 NSCs 体外扩增进入分化阶段后，再给予一定浓度的BMP4 诱导 NSCs的分化方向 , 提高 ChAT的表达 , 促进 NSCs 向胆碱能神经元方向的分化。结果显示免疫荧光染色加BMP4培养的实验组的 ChAT阳性细胞明显比不加B

17、MP4培养的对照组的阳性细胞多 , 而且荧光较强; 流式细胞术的结果也提示实验组 ChAT阳性细胞率显著高于对照组( P < 0. 05 ;而 ChAT是胆碱能神经元的标志性酶。所以这项实验可提示BMP4对NSCs 确实具有胆碱能诱导分化作用。有实验研究观察发现不同浓度BMP4对端脑胆碱能前体细胞的产生和分化也有不同的影响,研究证实低浓度（20g/L）BMP4可诱导端脑胆碱能前体细胞发生和分化，而较高浓度（40g/L）BMP4可抑制其发生和分化 33 。 上述具有胆碱能诱导分化作用的细胞因子的研究进展，对于诱导NSCs定向分化为胆碱能神经元技术的完备有重大意义，是神经干细胞用于治疗AD等

18、引起的脑损伤或神经元缺损很有必要的基础研究。然而如何诱导NSCs在病变部位定向分化为胆碱能神经元，或者如何将保证体外诱导生成的胆碱能神经元的存活率及质量并将其顺利送达神经元损伤部位，这些是研究者们需要更进一步探讨的问题。 参考文献 1 Postina R , Schroeder A , Dewachter I ,et al . A disintegrin - metallo2 proteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse model J . J

19、 Clin Invest , 2004 , 113(10 : 1 456 - 1 464。 2 Gabuzda D , Busciglio J , Chen L B. Inhibition of energy metabolism al2ters the processing of amyloid protein and induces a potentially amyloid2genic derivative J . J Biol Chem , 1994 , 269 ( 18 : 136 232 -136 238. 3 Trommer B L , Shah C , Yun S H ,et

20、al . ApoE isoform - specific effects on L TP : blockade by oligomeric amyloid - beta1 - 42 J . NeurobiolDis ,2005 , 18 (1 : 75 - 82. 4 Svensson A L ,Nordberg A. Beta - est radiol attenuate amyloid beta -peptide toxicity via nicotinic receptors J . Neuroreport , 1999 , 10 (17 :3 485 - 3 489. 5 Huber

21、A , Stuchbury G, Burkle A ,et al . Neuroprotective therapies for Alzheimer' s disease J . Curr Pharm Des ,2006 , 12 (6 :705 - 717. 6 Sast re M , Klockgether T ,H eneka M T. Cont ribution of inflammatory processes to Alzheimer' s disease : molecular mechanisms J . Int J DevNeurosci ,2006 , 24

22、 (2 - 3 :167 - 176. 7 Peng S , Wuu J , Mufson E J ,et al . Precursor form of brain - derived neurot rophic factor and mature brain - derived neurot rophic factor are ecreased in the pre - clinical stages of Alzheimer' s diseaseJ . J Neu2 rochem. , 2005 , 93 (6 : 1 412 - 1 421. 8 Enna SJ, Coyle J

23、T. In pharmacological management of neurological and psychiatric disorders M. New York:McGraw-Hill Professional, 1998:267- 316. 9 Taras enko YI, Yu Y, Jordan PM, et al . Effect of growth factors onprol iferation and phenotypic diffe2ntiation of human fetal neural s temcel ls .J Neurosci Res 2004; 78

24、(5:625-636 10 Whi ttemore SR, Moras sutti DJ , Wal ters WM, et al . Mi togen and subs trate differential ly affect the l ineage res triction of adul t subventricular zone neural precursor cel l populations . Exp Cel l Res 1999; 252(1:75-95 11 Mehler MF, Mabie PC, Zhang D, et al .Bone morphogenetic p

25、roteins in the nervous sys tem.Trends Neurosci 1997; 20(7: 309-317 12 Park HC, Mehta A, Richardson JS, et al .ol ig2 is required for zebrafish primary motor neuron and ol igodendrocyte development.Dev Biol 2002;248(2: 356-368 13 Varley JE, Maxwel l GD.BMP-2 and BMP-4, but not BMP-6, increas e the nu

26、mber of adrenegic cel ls which develop in quai l trunk neural cres tcul tures .Exp Neurol 1996; 140(1: 84-94 14 Huang Z,Tang XM, Cambi F. Down regulation of the retinoblas toma protein (rb is as sociated wi th rat ol igodendrocyte differentiation. Mol Cel lNeuros ci 2002; 19(2:250-262 15 Kim JK, Cho

27、i BH, Park HC,et al .Effects of GM-CSF on the neuralprogeni tor cel ls . J Neuroreport 2004; 15(14:2161-2165 16 谭雪锋, 金国华, 田美玲, 等.白介素- 1及与白介素- 11、 白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元的分化J .解剖学报,2005, 36(4:351-355 17 邓红, 邹飞, 罗海吉.全反式视黄酸对新生大鼠纹状体神经干细胞向神经元样细胞分化的作用J .第一军医大学学报,2005,25(11:1357-1374. 18 王飞,

28、黄强, 李世亭, 等.全反式维甲酸诱导神经干细胞分化实验研究.J . 中华神经外科疾病研究杂志, 2005,4(2:145-148. 19 谭雪锋, 金国华, 田美玲, 等.白介素- 1及与白介素- 11、 白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元的分化J .解剖学报,2005, 36(4:351-35521 20 Eleni R, Kerstin K . G DNF p r omotes neuronal differentiati on and do2paminergic devel opment ofmouse mesencephalic neuros

29、pheres J .Neurosci Lett, 2004, 361: 522 55. 21 Ha DH , Robertson RT , Roshanaei M, et al . Enhanced survival and morphological features of basal forebrain ch olinergic neurons in vitro :role of neurotrophins and other potential cortically derived cholinergic trophic factors. J Comp Neurol , 1999 , 4

30、06 : 156 - 170. 22 Ward NL , Hagg T. BDNF is needed for postnatal maturation of basal forebrain and neostriatum cholinergic neurons in vivo. Exp Neurol ,2000 , 162 : 297 - 310. 23 Calza L, Giuliani A, Fernandez M, et al. Neural stem cells and cholinergic neurons: Regulation by immunolesion andtreatment with mitogens, retinoic acid, and nerve growth factorJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(12:7325. 24 熊咏，田美玲，秦建兵等.NGF诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞和AChE阳性神经元分化的作用.南通大学学报（医学版），2007，01-001-03. 25 毕研贞,余 茜. 碱性成纤维细胞生长因子与表皮生长因子对神经干细胞增殖与分化的影响 J . 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11 (4 : 13452 13