补体调节蛋白在三种干细胞缺陷性贫血中的表达及其意义的研究

1、    补体调节蛋白在三种干细胞缺陷性贫血中的表达及其意义的研究        摘要目的观察糖化磷脂酰肌醇（GPI)连接的补体调节蛋白（CRP）CD55和CD59在阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH) 、再生障碍性贫血( 再障）和骨髓增生异常综合征（MDS)患者的外周血血细胞表达的变化并分析其在上述疾病中的临床意义。方法采用荧光标记抗CD55和CD59单克隆抗体，流式细胞术测定30名正常人，21例PNH患者，31例再障患者及21例MDS患者外周血中性粒细胞、淋巴细胞和红细胞膜抗

2、原的表达。结果PNH患者三种血细胞的CD59表达均明显降低，而CD55的降低只见于中性粒细胞和红细胞;PNH患者的CD59-中性粒细胞比例均高于10%，红细胞CD59表达情况与疾病的严重程度相关。再障患者中性粒细胞表达CD55和CD59亦较对照显著降低，但程度比PNH患者为轻。MDS患者血细胞CD55和CD59的表达无显著变化。结论测定CRP在PNH诊断和鉴别诊断中具有重要价值；就诊断敏感性和特异性而言，CD59优于CD55,中性粒细胞优于淋巴细胞和红细胞。再障患者血细胞CRP的降低表明其与PNH关系密切，但欲通过测定CRP鉴别两者，则须进一步确定其判别界限。有时再障与低增生性MDS较难鉴别，

3、测定CRP可以有所帮助。关键词补体血红蛋白尿,阵发性贫血,再生障碍性骨髓增生异常综合征流式细胞术Studies on the expression of complement regulatory proteins in three kinds of stem cell defect anemias and its clinical implicationsXU Conggao,ZHANG Ti,ZHAO Rui,et al.Hematology Research Laboratory,Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jin

4、an250012AbstractObjectiveTo investigate the expression of membrane associated complement regulatory proteins(CRP)CD55 and CD59 on the peripheral blood cells in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH),aplastic anemia(AA) and myelodysplastic syndrome (MDS) and its clinical implications.

5、MethodsExpression of CD55 and CD59 on neutrophils,lymphocytes and erythrocytes was analyzed with flow cytometry, using FITC and PE labeled anti-CD55 and CD59 monoclonal antibodies. ResultsCD55 and CD59 expression on neutrophils was significantly decreased in 21 PNH patients (including 2 cases of AA-

6、PNH syndrome). CD59- cells in neutrophils were constantly in excess of 10% in all of the PNH patients .Reduction in CD59 expression on erythrocytes was related to the severity of the disease.CD55- neutrophils were also significantly increased in PNH patients but with a greater variation.Expressions

7、of CD55 and CD59 on neutrophils were remarkably decreased in 31 AA patients but to a less extent as compared to PNH.No significant difference in the expressions of CD55 and CD59 was found in all the 21 MDS patients.ConclusionExpression of CRP is reduced in PNH and its related disorder-AA but remains

8、 unchanged in MDS.Flow cytometric analysis of complement regulatory proteins is of value in diagnosis and differential diagnosis of PNH,AA and MDS.In terms of diagnostic sensitivity and specificity,CD59 is superior to CD55,and neutrophil is superior to lymphocyte and erythrocyte.KeywordsComplementHe

9、moglobinuria,paroxysmalAnemia,aplasticMyelodysplastic syndromeFlow cytometry补体调节蛋白存在于血细胞生长发育的各个阶段，其功能为调节补体介导的溶膜反应过程。衰变加速因子(DAF)和反应性溶血膜抑制物（MIRL)是两种主要的补体调节蛋白，已分别被命名为CD55和CD59。补体调节蛋白必须通过糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白固定于细胞膜上。GPI缺陷将造成细胞膜补体调节蛋白表达减少或缺如，使细胞易于遭受补体系统的溶破作用。我们利用流式细胞术检测了几种干细胞异常所致的贫血，包括阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH）、再生障碍性贫血

10、（再障）和骨髓增生异常综合征(MDS)患者的外周血血细胞CD55和CD59的表达情况，并分析其临床意义。病例和方法1病例PNH 21例,包括2例再障-PNH综合征,其中男14例,女7例,中位年龄37岁（2157岁）；再障 31例，男21例，女10例，中位年龄36岁（1285岁），均为慢性再障患者；MDS 21例，男17例，女4例，中位年龄45岁（2173岁）。患者均为山东医科大学附属医院住院或门诊病例，诊断均符合全国诊断标准1。30名健康人作为正常对照组。2试剂和材料荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记鼠抗人CD55抗体、荧光素藻红蛋白(PE)标记鼠抗人CD59抗体及其相应阴性对照均为PharMi

11、ngen产品。溶血素为FACS Lysing Solution（购自BD公司）。3检测方法3.1标本采集及制备：采集静脉血3ml，肝素抗凝。粒细胞和淋巴细胞表型检测采用全血溶血法。红细胞用密度梯度离心法取得，再用10g/L的BSA-PBS缓冲液制备成浓度为106/ml的细胞悬液。3.2荧光标记和测定：分设实验管和对照管，每管加全血或红细胞悬液100l，实验管加入20l荧光标记抗体，对照管加入相应鼠Ig-FITC或Ig-PE 20l，室温避光孵育30分钟。白细胞管加溶血素1ml，10分钟后离心，PBS洗涤2次，加入1ml PBS悬浮细胞。红细胞管荧光染色后，不加溶血素，PBS洗涤2次，加PBS

12、1ml混悬待测。流式细胞仪为Becton-Dickinson FACS Vantage。激光光源为氩离子激光器，激发波长488nm。利用Cell Quest软件进行资料采集和分析，用前向角散射对侧向角散射散点区分血细胞群体，用门技术（gating）圈出欲分析的细胞群体。每份标本检测10000个细胞。4统计学处理数据以均值±标准差(<"wpe1.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174037533.jpg" 13 21>±s)表示,组间比较采用t检验。结果30名正常

13、人外周血中性粒细胞、淋巴细胞和红细胞的CD55和CD59表达率见表 1 。正常人CD55表达在中性粒细胞呈单一阳性群体,而在淋巴细胞和红细胞均呈阴性和阳性两种群体。CD59在三系细胞中均呈单一阳性群体表达。CD55和CD59抗原在 PNH患者血细胞中的表达率见表 2。PNH患者红细胞和淋巴细胞的CD55表达率个体差异较大，红细胞与正常对照比较明显下降，差异有显著意义（t=2.593,P0.05），淋巴细胞CD55表达率与正常对照比较,差异无显著性(t=1.489,P0.05)。中性粒细胞CD55表达率明显降低(t=6.229,P0.01)。三种血细胞CD59表达率均明显低于正常对照(中性粒细胞

14、t=8.151,P0.01；淋巴细胞t=3.148,P0.01；红细胞t=6.742,P0.01)。中性粒细胞CD59-群体比例均大于10%。将PNH患者按病情分为频发组、偶发组和不发组。频发组与偶发组和不发组比较，中性粒细胞CD55和CD59的表达率均明显降低（CD55：频发组与偶发组比较,t=3.388,P0.01;频发组与不发组比较,t=6.713,P0.01。CD59：频发组与偶发组比较,t=2.946,P0.01;频发组与不发组比较,t=7.677,P0.01），偶发组和不发组比较，差异无显著性(CD55:t=0.173,P0.05;CD59：t=0.786,P0.05）。各组红细胞

15、CD55表达率的差异无显著性（频发组与偶发组比较,t=1.145,P0.05;频发组与不发组比较,t=0.073, P0.05; 偶发组与不发组比较,t=0.238,P0.05)。CD59表达率频发组显著低于偶发组与不发组(频发组与偶发组比较,t=6.370,P0.01;频发组与不发组比较,t=9.262,P0.01）;偶发组与不发组比较，差异无显著性（t=1.829,P0.05)，其结果见表3。表1正常人血细胞CD55和CD59标记率(%,<"wpe2.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/2010031717403

16、7909.jpg" 13 21>±s)细胞类型例数CD55CD55CD59CD59中性粒细胞3099.5±0.40.5±0.399.3±0.50.7±0.5淋巴细胞3042.4±6.457.5±6.590.3±3.99.7±3.9红细胞3025.1±16.571.6±18.998.5±3.30.9±0.9     表2PNH患者血细胞CD55和CD59表达率(%，<"wpe3.jpg (766

17、bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174037487.jpg" 13 21>±s) 细胞类型例数CD55CD55CD59CD59中性粒细胞2137.5±40.3*63.1±41.2*35.8±31.7*64.3±33.2*淋巴细胞2143.7±27.857.2±29.077.4±11.2*22.5±10.9*红细胞2117.3±12.6*82.6±11.8?50.2±27.5*50.0±2

18、8.2*     注:*与正常对照比较，P0.05 再障和MDS患者中性粒细胞及淋巴细胞的CD55和CD59抗原表达率见表4。与正常对照比较，再障患者中性粒细胞的CD55和CD59表达率均明显降低(CD55:t=4.357,P0.01;CD59:t=3.124,P0.01);淋巴细胞CD55和CD59的表达率无显著变化(CD55：t=1.425,P0.05;CD59：t=1.002,P0.05)。MDS患者中性粒细胞和淋巴细胞的CD55及CD59的表达率与正常对照比较,差异均无显著性(中性粒细胞CD55:t=1.471,P0.05;CD59:t=0.93

19、3,P0.05。淋巴细胞CD55:t=0.268,P0.05;CD59:t=0.183,P0.05)。讨论PNH是一种后天获得性克隆性血细胞膜缺陷所致的溶血病。近年来对该病的研究取得了重要进展，明确了其发病机制是GPI锚生成障碍2,3。GPI锚生成过程有多个基因参与，包括PIG-A、B、C、F、G、H等,已经证明PIG-A突变是PNH发病的关键4,5。因为GPI合成障碍发生在造血干细胞水平，所以三系血细胞膜上CD55和CD59的表达均可出现异常，但其异常表达的形式有所不同。正常对照中性粒细胞呈单一阳性群体，而PNH中性粒细胞的CD55和CD59表型出现阴性和阳性两个群体,其中CD55表达率个体

20、差异较大，21例患者中就有3例在正常范围;CD59的阳性率下降，全部PNH患者的CD59-中性粒细胞比率均大于10%(13%96%)。2例再障-PNH患者CD59-细胞比率亦大于10%。因此,就诊断敏感性而言，CD59优于CD55。目前尚无用流式细胞术测定补体调节蛋白CD55和CD59诊断PNH的统一判别界线。根据本研究对31例再障的测定结果，CD59-中性粒细胞的均值±2标准差的上限为 9.9%,结合其他作者的报道，PNH患者外周血的CD59-中性粒细胞均大于10%4 ,5，我们建议以CD59-中性粒细胞大于10%作为 PNH诊断依据，供参考和验证。正常对照淋巴细胞CD55和CD5

21、9表型均可出现阴性群体,淋巴细胞出现CD55阳性与阴性明显分开的两个群体;而CD59表型主峰由阳性细胞群体组成，少量细胞表达逐渐减弱，拖尾进入阴性区域。PNH患者的淋巴细胞CD55表达与正常对照比较，差异无显著性;其CD59表达虽显著下降，但因患者间个体差异颇大，且淋巴细胞荧光标记强度呈连续演变过程，不易确定阳性和阴性细胞群体之间的界线。因此,PNH淋巴细胞CD55和CD59表型测定对临床诊断帮助不大。正常对照红细胞CD55可出现阴性群体，而CD59则为单一阳性群体。PNH患者红细胞的CD55和CD59表达率明显降低,与正常对照比较，差异有显著意义。PNH患者红细胞CD55和CD59的表达按标

22、记荧光强度可划分为三类细胞,PNH 型细胞的CD55和CD59表达与正常红细胞相似；PNH 型细胞为CD55和CD59表达完全阴性的细胞；PNH 型细胞为荧光标记强度介于型和型之间的细胞。个体PNH患者表达形式可为型+型或型+型或型+型+型的不同组合。型细胞多为过渡群体。我们在本研究中发现PNH患者红细胞CD55和CD59表达与病情相关，频发组CD55-和CD59-群体明显高于偶发组和不发组，提示检测红细胞的CD55和CD59标记率对监测病情有一定意义。值得注意的是红细胞寿命较长，且易受输血的影响，在分析结果时应予充分注意。总体而言，检测三类血细胞CRP表型在诊断PNH上的意义按重要性顺序应该

23、是中性粒细胞红细胞淋巴细胞。表3PNH各组中性粒细胞和红细胞CD55和CD59表达率(%,<"wpe4.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174037618.jpg" 13 21>±s)组别例数中性粒细胞红细胞CD55+CD59+CD55CD59频发组95.7±4.4*11.8±10.3*10.2±7.629.8±21.8*偶发组961.5±44.146.7±35.824.0±14.760.5±

24、10.2不发组378.1±17.175.4±4.523.5±8.382.4±3.7     注:*与偶发组和不发组比较，P值均0.01 表4再障和MDS患者血细胞CD55和CD59表达率(%,<"wpe6.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174038181.jpg" 13 21>±s)组别及细胞类型例数CD55CD55CD59CD59再障组31中性粒细胞94.2±2.3*6.8

25、77;2.3*95.8±2.9*4.3±2.8*淋巴细胞38.1±15.562.8±15.883.5±17.213.8±17.1MDS组21中性粒细胞98.9±0.91.1±0.699.1±0.71.0±0.6淋巴细胞45.3±13.855.6±14.188.2±11.912.0±6.3     注:*与正常对照比较，P0.01 我们检测了31例慢性再障患者中性粒细胞和淋巴细胞CD55和CD59的表达率。结果发现再障

26、患者的中性粒细胞CD55和CD59表达率均有所降低。部分再障患者可检测到PNH样异常血细胞6,7,其机制尚未明确,但提示此类患者有克隆性异常造血,且往往对免疫抑制治疗反应不良。再障和PNH关系密切，两者可互相转变或共存。目前再障-PNH综合征的诊断仍以出现Ham试验阳性为主要依据，但此时病情已趋明显。现有的资料已证明，血细胞CRP检测的敏感性优于Ham试验，为早期诊断再障-PNH综合征提供了帮助。有的作者建议以CD59-中性粒细胞大于5%为判别界线8。据此，则本系列有8例CD55-群体高于此值，占27%，有9例CD59-群体超过此值，占30%，但此时他们的Ham试验结果均为阴性。另外，2例再障

27、-PNH患者CD59-中性粒细胞分别占11%和15%,且具有其它PNH特征。鉴于再障向PNH转化是一个渐进的过程，两者之间判别值的确定在很大程度上带有主观性。因此，我们认为对此类患者宜进行动态观察，在长期随访和积累较大患者样本后才可望得出一个较可靠的判别诊断界限。再障患者淋巴细胞CD55表达率与正常对照比较，差异无显著性，CD59表达率显著降低，但个体波动较大，与正常对照多有重叠，其意义尚难确定。MDS和PNH虽均为获得性造血干细胞疾病，但两者发病机制迥然不同。我们发现MDS患者中性粒细胞和淋巴细胞CD55和CD59的表达率与正常对照比较，差异无显著性。中性粒细胞CD55-和CD59-群体未见

28、超过5%者。鉴于有些低增生性MDS与再障的鉴别比较困难，此时检测血细胞CRP则可能有所帮助。作者单位:徐从高张锑赵睿张茂宏250012济南,山东医科大学附属医院血液学研究室参考文献1张之南,主编.血液病诊断及疗效标准.第1版.天津:天津科学技术出版社,1991.2Mahoney JF,Urakaze M,Hall S,et al.Defective glycosylphosphatidylinositol anchor synthesis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria granulocytes.Blood,1992,79:1400-1403.3Takada J